شکل ۱-۸، آنچه سبب موفقیت این تکنیک نسبت به سایر روش های تایپینگ شده است، سریع بودن و سادگی آن است. مراحلی که در MLVA انجام می شود شامل: ۱) کشت دادن باکتری ۲) استخراج ژنوم باکتری ۳) انجام دادن واکنش PCR برای لوکوس های VNTR 4) الکتروفورز محصولات PCR بر روی ژل آکاروز ۵) عکس گرفتن از ژل پس از انجام الکتروفورز ۶) تبدیل کردن اندازه ی باند ها به تعداد تکرار و آنالیز داده ها که در مرحله ی آخر صورت می گیرد.

1. 1. در دسترس بودن^[۷۰]: به وجود داشتن تجهیزات، مواد مصرفی و نوع مهارت به تکنیک مورد نظر وابسته است. تکنیک هایی که بر پایه ی PCR هستند مانند MLVA، تنها نیاز به یک دستگاه ترموسایکلر دارند ولی در تکنیک هایی مثل PFGE نیاز به مواد و دستگاه هایی است که دارای قیمت بسیار بالایی هستند. در ضمن تکنیک هایی که بر پایه ی PCR می باشند را می تواند در یک آزمایشگاه معمولی انجام پذیرد و نیاز به افرادی که دارای تخصص و تبحر هستند، نیست(۷, ۲۴).

1. 1. سرعت انجام آن^[۷۱]: زمان مورد نیاز جهت انجام و آماده سازی یک تکنیک را اصطلاحا سرعت آن تکنیک می گویند. تکنیک PFGE یک تکنیک زمانبر می باشد و زمان مورد نیاز برای انجام حداقل سه روز کاری می باشد ولی به دلیل آنکه MLVA یک روشی است که بر پایه ی PCR صورت می پذیرد به همین دلیل در کمترین زمان ممکن( چند ساعت) قابل انجام است. سرعت تکنیک هایی نظیر ERIC-PCR، REP-PCR، RAPD-PCR، MLST و MLVA به دلیل مبتنی بودن بر PCR نسبت تکنیک هایی مثل: ریبوتایپینگ^[۷۲]و PFGE بسیار بالاتر است(۷, ۲۴).

1. 1. تکرارپذیری^[۷۳]: توانایی یک تکنیک ژنوتایپینگ در تولید نتیجه های کاملا یکسان و شبیه را بر روی یک نمونه ی مشخص در مکان ها و زمان های مختلف را اصطلاحا تکرار پذیری می نامند. تکرار پذیری به مسائل مختلفی وابسته است که عبارتند از دستور العمل هایی که هنگام انجام یک تکنیک استفاده می شود و پایداری الل ها. قدرت تکرار پذیری تحت تاثیر فاکتور هایی قرار دارد که این فاکتور ها عبارت اند از: آنالیز و تفسیر داده ها، تجهیزات و دستگاه هایی که حین انجام تکنیک از آنها استفاده می شوند، جگونگی تهیه مواد مورد نیاز جهت انجام تکنیک مثل نحوه استخراج DNA و تفاوت هایی که در شرایط رشد وجود دارد و ترکیبات و موادی که طی واکنش مصرف می شوند. تکنیک هایی که برای ژنوتایپینگ انتخاب می شوند باید به گونه ای باشند که هم در آزمایشکاه و هم در سایر آزمایشکاه ها، قابلیت تکرار را داشته باشند. بکار گرفتن افراد متخصص و آموزش دیده و استفاده از دستورالعمل استاندارد، باعث می شود به میزان قابل توجهی تکرار پذیری افزایش یابد. داده های MLVA همانند داده های MLST به شکل رقم هایی ذخیره می گردند، به همین دلیل به راحتی می توان این داده ها را به سایر آزمایشگاه ها و مراکز پژوهشی انتقال داد و حتی می توان این داده ها را با هم مقایسه نمود. برای استاندارد سازی تکنیک PFGE نیز تلاش هایی انجام شده است مثل: دستورالعمل های استاندارد CDC درباره ی اشرشیا کلی انترو هموراژیک^[۷۴]O157:H7 و یا سایر باکتری ها(cdc.gov/pulsnet). ذخیره کردن داده ها در بانک های اطلاعاتی و همچنین استفاده کردن از این داده ها یک مزیت بسیار مهم می باشد(۷, ۲۸).

1. 1. انطباق اپیدمیولوژیکی^[۷۵]: نتایجی که از یک روش ژنوتایپینگ بدست می آید باید بتواند ارزیابی درست و صحیحی از جمعیت باکتریایی به ما نشان دهد. این تکنیک ها باید در اپیدمی ها ( همه گیری) کاربرد داشته باشند و باید بتوانند بین سویه هایی که باعث ایجاد اپیدمی شده اند ( سویه هایی که احتمالا از یک سویه ی واحد یا کلون مشتق شده اند) و سایر سویه های غیر مرتبط، تمایز قائل شوند. در همان ابتدا از تکنیک MLVA در اپیدمی ها حهت بررسی اپیدمیولوژکی استفاده شد و توانست همانند PFGE و MLST در اپیدمی ها کاربرد داشته باشد(۲۴).

1. 1. قدرت تفکیک و تمایز^[۷۶]: قدرت تفکیک و تمایز در اصطلاح به توانایی یک تکنیک در تمایز دو ایزوله ی غیر مرتبط( که به صورت تصادفی از یک جمعیت باکتریایی جدا شده است)، گفته می شود. برای محاسبه ی قدرت تفکیک و تمایز از ضرایب گوناگونی استفاده می شود که از این ضرایب می توان به ضریب تنوع سیمپسون^[۷۷]و ضریب هانتر- کاتسون^[۷۸] اشاره نمود. عددی که توسط این ضرایب محاسبه می شود، چیزی بین صفر و یک می باشد. عدد صفر نشان دهنده ی عدم تنوع است و عدد یک نشان دهنده ی حداکثر میزان تنوع می باشد. تکنیک ژنوتایپینگی که قدرت تفکیک و تمایز آن، حداقل ۰.۹۵ یا بلالاتر باشد، یک تکنیک مناسب و ایده آل می باشد. قدرت تفکیک و تمایز تکنیک های ژنوتایپینگ همچون ERIC- PCR، REP- PCR و RAPD-PCR بسیار کمتر از MLST، PFGE و MLVA می باشد. قدرت تفکیک وتمایزMLVAاگرازPFGE وMLST بالاتر نباشد، کمتر هم نمی باشد(۲۴).

1. 1. پایداری^[۷۹]: پایداری ماکر هایی که برای ژنوتایپینگ استفاده می گردند، از اهمیت ویژه ای برخوردار می باشد. این مارکر ها زمانی قابل اطمینان هستند که در هر سویه ی باکتریایی به سرعت دچار تغییرنشوند.این مارکرهانبایددرجداسازی اولیه هر ایزوله، نگهداری و کشت مجدد این ایزوله­ها تغییر پیدا کنند. تنها مسئله ای که غیر قابل اجتناب است این موضوع می باشدکه همیشه ماشاهدنوترکیبی ها و جهش ها در جمعیت های باکتریایی هستیم. مارکر هایی که برای MLVA انتخاب می شود همان توالی های VNTR می باشد. VNTR ها دارای پایداری قابل توجهی هستند در نتیجه MLVA می تواند با سایر روش ها مثل PFGE و MLST رقابت کند. حال باید به این نکته توجه داشته باشیم که هر چقدر اندازه ی توالی های VNTR، بزرگتر باشد، سرعت تکامل در آنها کمتر می باشد و در نتیجه میزان تنوع آنها نیز پایین تر است و نمی توانند به سرعت دچار تغییر شوند. بر عکس این موضوع نیز وجود دارد، اگراندازه ی توالی­هایVNTR،کوچک باشد، سرعت تکامل در آنها بیشتر می باشد و در نتیجه میزان تنوع این توالی ها بالاتر است و به همین دلیل سرعت تغییر در آنها نیز بالاتر می باشد. آنچه در MLVA دارای اهمیت می باشد، نوع انتخاب مارکرها می باشد. از مارکرهایی با اندازه ی تکرار بزرگتر در بررسی های اپیدمیولوژیکی استفاده می گردد. از مارکرهایی با اندازه تکرار کوتاه تر برای ژنوتایپینگ و تمایز باکتری های مونومورفیک^[۸۰]مثل سالمونلا انتریکا سرووار اینفنتیس، سالمونلا انتریکا سرووار تایفی، سالمونلا انتریکا سرووار انتریتیدیس، مایکو باکتریوم توبرکلوزیس، شیگلا سونئی و اشرشیا کلی انترو هموراژیک O157:H7 استفاده می گردد(۲۴, ۲۹, ۳۰).

۱-۴- اهداف پایان نامه
۱-۴-۱- هدف علمی پایان نامه
ژنوتایپبنگ سویه های سالمونلا انتریکا سرووار انتریتیدیس جدا شده از نمونه های بالینی در تهران بر پایه روشMultilocus VNTR Analysis( MLVA)
۱-۴-۲- اهداف جزئی

1. 1. تعیین هویت و بررسی تنوع اللی در هر لوکوس VNTR در جمعیت سویه های سالمونلا ی مورد نظر

1. 1. انتخاب پرایمر مناسب جهت الل ها برای انجام PCR

1. 1. انجام PCR برروی ژن ها و پرایمر انتخابی

1. 1. آنالیز و بررسی داده ها

۱-۴-۳- اهداف کاربردی
بکارگیری یک روش سریع، کم هزینه و ارزشمند جهت ژنوتایپینگ برای بررسی و شناسایی میکروارگانیسم ها در زمینه پیشگیری و کنترل عفونت ها
۱-۵- فرضیه ها

1. 1. لوکوس­هایVNTR در سویه های سالمونلا انتریکا سرووار انتریتیدیس از تنوع بالایی برخوردارند

1. 1. سویه های سالمونلا از نظر ژنوتیپ با روش MLVA قابل طبقه بندی هستند.

۱-۶- سئوالات

1. 1. آیا لوکوس های VNTR در سویه های سالمونلا انتریکا سرووار انتریتیدیس از تنوع بالایی برخورد دارند؟

1. 1. آیا سویه های سالمونلا از نظر ژنوتیپ با روش MLVA قابل طبقه بندی هستند؟

۱-۷- ضرورت انجام تحقیق
چون روش های مولکولی زیادی نظیر PFGE، MLST و MLVA و غیره جهت ژنوتایپینگ سویه های سالمونلا وجود دارد، MLVA نسبت به سایر روش ها نظیر PFGE از نظر اقتصادی مقرون به صرفه بوده و با امکانات کمی( PCR و الکتروفورز) قابل انجام است.
۱-۸- جنبه جدید بودن و نوآوری تحقیق
از آنجاییکه از این تکنیک برای ژنوتایپینگ سالمونلا در کشور استفاده نشده است لذا برای اولین بار قصد داریم سویه های سالمونلا انتریکا سرووار انتریتیدیس را با این روش دسته بندی نمائیم.
۱-۹- واژه نامه ها و اصطلاحات فنی

1. 1. ژنوتایپینگ باکتری ها: نوعی روش مولکولی که برای طبقه بندی و دسته بندی ایزوله ها یا سویه های یک گونه ی باکتریایی خاص برای مطالعه ی روابط تکاملی یا قرابت ژنتیکی بین آنها استفاده می شود.

1. 1. VNTR: VNTR در اصطلاح به تکرار های پشت سرهم با تعداد متغییر گفته می شود. این توالی ها معادل ماهواره ها در ژنوم می باشند.

1. 1. MLVA( آنالیز چند لوکوسی تکرار های پشت سرهم): نوعی تکنیک مولکولی می باشد که برای ژنوتایپینگ باکتری ها استفاده می شود. این تکنیک مبتنی بر PCR بوده و اساس آن VNTR ها می باشد.

1. 1. پروفایل اللی: پروفایل اللی در اصطلاح به مجموعه ی تعداد تکرار های VNTR می گوند برای مثال سویه ی شماره یک با پروفایل اللی ۲-۳-۵-۶-۷-۴-۱ و سویه ی شماره ی دو با پروفایل اللی ۳-۲-۴-۵-۴-۷-۱

1. 1. SLV: اگر پروفایل اللی دو ایزوله نسبت به هم در یک جایگاه لوکوسی( یک لوکوس VNTR) متفاوت باشد،آنها نسبت به یکدیگر، SLV می باشند مانند ۳-۲-۱-۷-۴-۲-۳ نسبت به ۳-۲-۱-۷-۴-۲-۴ SLV می باشد.

1. 1. DLV: اگر پروفایل اللی دو ایزوله نسبت به هم در دو جایگاه لوکوسی( دو لوکوس VNTR) متفاوت باشند، آنها نسبت به یکدیگر، DLV می باشند.

1. 1. کلونال کمپلکس: در اصطلاح به یک ایزوله( مرکزی) به همراه SLV ها و DLV ها ی مربوط به آن دودمان یا کلونال کمپلکس می گویند.

1. 1. Minimum Spanning tree(MST): نوعی الگوریتم ریاضی می باشد که کوتاهترین مسیرها بین نقاط مختلف را که محاسبه می نماید. از MST جهت ترسیم کوتاهترین مسیر های تکاملی در آنالیز داده های حاصل از تکنیک های MLVA و MLST استفاده می گردد..

مروری بر ادبیات تحقیق و پیشینه تحقیق