روش‌های انتخاب لاین خالص، روش شجره‌ای و تلاقی برگشتی مخصوصا جهت انتقال صفت مقاومت به بیماری‌ از گونه‌های مقاوم به گونه‌های حساس تجاری و انتخاب دوره‌ای از دیرباز برای اصلاح کلزا استفاده شده‌اند [۱۴۹]. اصلاح با روش دابلهاپلوئید از طریق کشت بساک و کشت میکروسپور نیز در کلزا اجرا شده است [۱۰۸، ۱۳۸، ۱۵۲، ۱۷۰]. با توجه به وجود دگرگشنی در کلزا تهیه هیبرید و استفاده از قابلیت هتروزیس نیز یکی از روش‌های مناسب و مفید در اصلاح کلزا می‌باشد. در کشورهای چین، استرالیا و کانادا به طور وسیعی ارقام هیبرید کشت میشوند [۸۲، ۱۷۲]. مهندسی ژنتیک نیز در زمینه تولید ارقام تراریخت کمک بسیار شایانی در جهت تولید ارقام تجاری جدید نموده است [۱۳۲، ۱۶۶]. با بهره گرفتن از موتاژنهای شیمیایی و فیزیکی تنوع قابل ملاحظه‌ای را در جوامع گیاهی کلزا ایجاد کرده‌اند. با بهره گرفتن از کشت بافت و جهشزایی به کمک مواد شیمیایی توانسته‌اند در ترکیب اسید چرب روغن دانه کلزا تغییر ایجاد کنند [۱۶۷]. تلفیق روش‌های اصلاحی نوین با روش های اصلاحی کلاسیک آینده درخشانی را برای اصلاح کلزا رقم خواهد زد.

۲-۱۶- تجزیه تحلیل‌های چند متغیره

روش های تجزیه و تحلیل چند متغیره که بدون از بین بردن مقدار زیادی از اطلاعات مفید قادر به کاهش حجم داده های مورد مطالعه جهت تجزیه و تحلیل دقیقتر برای بهنژادگران هستند، از اهمیت ویژهای برخوردار میباشند [۷۸]. در این خصوص استفاده از ضرایب همبستگی بین صفات متداول میباشد که مبین روابط علی و معلولی خصوصیات مورد مطالعه نمیباشد، چرا که تعدادی عامل ناشناخته در این ارتباطات نقش دارند که کاربرد همبستگی در درک و تفسیر آنها کافی نیست [۲۹، ۱۰۵].
در واقع تجزیه چند متغیره عبارت از کاهش حجم داده ها در روشهایی است که با تعداد زیادی اندازه گیری(متغیر) روی یک یا تعداد بیشتری نمونه به صورت همزمان سر و کار دارد. در تجزیه چند متغیره پیرامون روابط همزمان متغیرها بحث میشود .در تکنیکهای آماری چند متغیره پیرامون میانگین و یا واریانس یک متغیر و یا رابطه دو متغیر بحث نمیشود بلکه کوواریانسها و همبستگیهای میان سه متغیر یا بیشتر بررسی میشود. بطور کلی می توان هدفهای استفاده از روش های آماری چند متغیره را در تحقیقات علمی به صورت کاهش داده ها و ساده کردن ساختار مورد مطالعه، پی بردن به ارتباط بین متغیرها، پیش بینی ارزش متغیرها، گروهبندی و ساختن فرضیه و آزمون آن خلاصه کرد [۴۱].از انواع روش های آماری چند متغیره می توان به رگرسیون و همبستگی چندگانه، تجزیه و تحلیل ضرایب مسیر،تجزیه به مولفه های اصلی، تجزیه به عاملها، تجزیه خوشه ای و تجزیه تابع تشخیص نام برد [۲۰، ۱۱۷].

۲-۱۶-۱- همبستگی بین صفات

همبستگی بین صفات یکی از معیارهای اندازه‌گیری ارتباط بین دو یا چند متغیر است. عدم لحاظ این ضرایب در برنامههای اصلاحی و انتخاب برای بهبود یک یا چند صفت ممکن است نتایج مطلوبی بدنبال نداشته باشد. لذا توجه به همبستگی بین صفات در برنامه‌های اصلاحی از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است [۶۰، ۶۵، ۷۵].
مطالعات تونکترک و سیفتسی [۱۵۸] نشان داد که با افزایش تعداد غلاف در بوته، تعداد دانه در غلاف، وزن هزار دانه و تعداد شاخه های فرعی در بوته، عملکرد دانه در گیاه کلزا افزایش یافته و همبستگی مثبت و معنیداری بین این صفات و عملکرد دانه وجود داشته است.
در مطالعهی دیگری مارجانویک جیرومیلا و همکاران [۱۲۲] همبستگی مثبت و معنیداری را بین هر کدام از صفات ارتفاع بوته، تعداد شاخه های فرعی، تعداد غلاف در بوته و وزن هزار دانه با عملکرد دانه در گیاه کلزا گزارش کردند. ایوانوسکا و همکاران [۹۹] نیز با مطالعه بر روی ارقام کلزا در دو محیط نشان دادند که عملکرد دانه با صفات تعداد شاخه فرعی، طول غلاف، وزن هزار دانه و تعداد غلاف در هر دو مکان همبستگی مثبت و معنیداری وجود داشته و با ارتفاع بوته در یکی از محیطها همبستگی داشته است. اوزر و همکاران [۱۳۱] ارتباط معنیداری را بین ارتفاع بوته و عملکرد دانه در بوته گزارش کردند و آنها همچنین بیان داشتند بین طول مدت گلدهی با عملکرد دانه ارتباط معنیداری وجود داشته است.

۲-۱۶- ۲- رگرسیون گام به گام

زمانی که تعداد متغیرهای مستقل زیاد باشند برای پیدا کردن تأثیرگذارترین آنها بر متغیر تابع (مثلاً عملکرد) و برآورد معادله رگرسیون روش‌های متعددی وجود دارد که متداولترین آنها رگرسیون گام به گام می‌باشد [۵۹، ۶۶]. در این روش ابتدا مهم‌ترین متغیر مستقل رگرسیون که باعث افزایش سریع R² می‌شود، وارد معادله رگرسیونی می‌گردد و به همین ترتیب متغیرهای بعدی وارد مدل می‌گردند [۸۴]. به این ترتیب با بهره گرفتن از روش رگرسیون مرحله‌ای می‌توان سهم هر صفت و میزان تأثیر آن بر عملکرد را تعیین کرد و صفاتی که بیشترین تأثیر را بر عملکرد دارند، در برنامه‌های اصلاحی و برای بهبود ژنتیکی عملکرد مورد توجه قرار داد [۱۲۸]. استفاده از رگرسیون گام به گام در کلزا نشان داده است که ۵ صفت شامل تعداد غلاف در بوته، تعداد دانه در غلاف، وزن هزار دانه، و تعداد گره در ساقه در مدل رگرسیونی قرار گرفته و عملکرد دانه کلزا را توجیه نمودند[۶۲]. در مطالعه مذکور، صفت تعداد غلاف در بوته با ضریب تبیین ۴۱/۰ به تنهایی بخش عمدهای از تغییرات عملکرد دانه را توجیه کرد و در مطالعات مشابهی [۹۹، ۱۲۹] نیز تجزیه رگرسیون گام به گام نشان داد که دو صفت تعداد غلاف در بوته و تعداد دانه در غلاف نقش تعیین کننده و مهمی در توجیه عملکرد دانه داشتهاند. در مطالعه دیگر انجام رگرسیون گام به گام برای عملکرد دانه در مقابل سایر صفات در کلزا نشان داده است که صفت وزن هزار دانه با ضریب تبیین ۶۴% به تنهایی بخش عمدهای از تغییرات مدل رگرسیونی را توجیه کرد و دیگر صفت وارد شده در مدل صفت پایان دوره گلدهی با ضریب تبیین ۷% بود [۲۲].

۲-۱۶-۳- تجزیه و تحلیل ضرایب مسیر

وقتی تعداد زیادی متغیر همبسته وجود دارد، نمی‌توان از آثار غیر مستقیم صفات بر روی یکدیگر چشم‌پوشی نمود و ضرایب همبستگی تحت تأثیر اثر غیرمستقیم صفات دیگر واقع شده که در این صورت تفسیر صحیحی از آنها به دست نمی‌آید [۶۹، ۱۰۵]. تجزیه مسیر روش مناسبی برای تعیین سهم نسبی این آثار می‌باشد. از این جهت در مطالعات مختلف، برای تشخیص مهمترین جزء مؤثر بر عملکرد از تجزیه مسیر استفاده می‌شود. همچنین روابط بین صفات را می‌توان برای تعریف شاخص انتخاب جهت گزینش ژنوتپ‌های برتر مورد استفاده قرار داد [۱۶، ۸۱]. در تجزیه ضرایب باید متغیرهای شرکت کننده در تجزیه را بر اساس روابط علی و معلولی، دانش قبلی محقق از ارتباط موجود بین متغیرها، روابط فیزیولوژیک بین صفات و یا براساس رگرسیون مرحله‌ای انتخاب نمود [۲۰، ۵۸، ۱۱۸].
در آزمایشهای مشابهی بر روی کلزا گوا و همکاران [۹۱] و صباغنیا و همکاران [۱۳۹] گزارش کردند که وزن هزار دانه دارای بیشترین اثر مستقیم مثبت بوده است و برخی محققین نیز گزارش کردند که صفت وزن هزار دانه و صفت پایان گلدهی بیشترین اثر مستقیم مثبت را روی عملکرد دانه نشان دادهاند و تعداد روز تا پایان گلدهی و وزن هزار دانه به صورت غیر مستقیم همبستگی منفی با عملکرد دانه داشته است [۲۲، ۶۲].

۲-۱۶-۴- تجزیه به عامل‌ها

تجزیه به عامل‌ها روشی برای کاهش حجم داده‌ها می‌باشد. در این روش مجموعه‌ای از متغیرها به چند دسته تقسیم می‌شوند که هر یک از این دسته‌ ها را یک عامل می‌گویند [۷]. در تجزیه به عامل‌ها کوواریانس یا همبستگی موجود در بین چندین متغیر بوسیله تعداد کمی عامل یا متغیر پنهانی غیر قابل اندازه‌گیری توصیف می‌شود. مزیت تجزیه به عامل‌ها این است که اگر متغیر یا عامل جدیدی خلق شد، در این روش تفسیر آسان‌تری خواهد داشت و در صورتی که محقق قصد ایجاد تعداد عامل کمتر با در برداشتن بیشترین اطلاعات را داشته باشد این روش مفیدتر است [۱۰۴]. ضرایب عوامل پنهانی به عنوان بار عامل‌ها معرفی می‌شود و نشان دهنده میزان تأثیر عامل‌ها در توجیه تغییرات متغیرها میباشد. تجزیه به عامل‌ها میتواند بر روی ماتریس همبستگی و یا ماتریس واریانس–کوواریانس انجام شود [۱۰۴]. در صورتی که عامل‌ها به راحتی و با اطمینان قابل تفسیر و توضیح دادن نباشند، از دوران عامل‌ها استفاده می‌شود که با این کار عامل‌هایی به دست می‌آیند که به آسانی قابل تفسیر هستند [۷].تجزیه به عامل ها در مطالعات ضابط و همکاران [۳۲] نشان داد که ۳ عامل اول بیشترین تغییرات را توجیه میکردند و عامل اول مهمتر از سایر عوامل بوده است و این عامل ها شامل صفات تعداد روز تا گلدهی، تعداد روز تا رسیدگی، شاخص برداشت و عملکرد اقتصادی بوده است.
در مطالعه دیگری صفات شاخص برداشت، تعداد غلاف در بوته، ارتفاع بوته، سرعت فتوسنتز و هدایت روزنه ای به ویژه در مرحله گلدهی و طول دوره رشد گیاه نقش مثبتی در افزایش عملکرد کلزا داشته‌اند[۵۰]. همچنین در مطالعه موسوی و همکاران [۴۸] چهار عامل اول مجموعاً ۵۹ درصد از تغییرات موجود بین صفات را توجیه نمودند، به طوری که عامل اول ۲۲ درصد از واریانس بین صفات را به خود اختصاص داد و نقش مهمی را از طریق متغیرهای طول غلاف و تعداد دانه در غلاف ایفا نموده است، لذا این عامل تحت عنوان عامل مخزن نامگذاری کرده‌اند. عامل دوم ۱۵ درصد از واریانس را توجیه نموده است و با توجه به ضرایب عاملی، روز تا گلدهی و روز تا غلافدهی که بیشترین نقش را داشتند عامل دوم به نام عامل سرعت رشد نامگذاری شده است. در مطالعه فوق، عامل سوم۱۲ درصد از واریانس بین صفات را به خود اختصاص داد و نقش مهمی را از طریق ارتفاع و عملکرد بیولوژیک ایفا نموده و لذا این عامل را تحت عنوان عامل عملکرد بیولوژیک نامگذاری نموده اند. عامل چهارم ۸ درصد از واریانس بین صفات را به خود اختصاص داد و نقش مهمی را از طریق متغیرهای تعداد غلاف در بوته و تعداد شاخه فرعی ایفا نمود، لذا این عامل را تحت عنوان عامل اجزای عملکرد نامیدند.

۲-۱۶-۵- وراثت‌پذیری

اهمیت نسبی عوامل وراثتی در تعیین ارزش فنوتیپی به قابلیت توارث معروف است و بسته به اینکه به ارزش ژنوتیپی یا اصلاحی ربط داده شود، دو مفهوم متفاوت پیدا می کند. نسبت واریانس افزایشی به واریانس فنوتیپی را قابلیت توارث خصوصی گویند که نشان دهنده میزان شباهت نتاج به والدین و ارثی بودن یک صفت می باشد [۵].
مطالعه علی و همکاران [۵۷] روی شاخصهای انتخاب برای بهبود عملکرد کلزای زمستانه نشان داد که حداکثر وراثت پذیری عمومی با ۹۰% برای روز تا رسیدگی به دست آمد و پس از آن به ترتیب روز تا گلدهی، وزن هزار دانه و عمکرد دانه قرار داشتند. صدیقی و همکاران [۱۴۷] به مطالعه تنوع ژنتیکی حاصل از القاء جهش در کلزا با اشعه گاما و اتیل متیل سولفونات به تنهایی و به صورت ترکیبی پرداختند وآنها بیشترین میزان وراثتپذیری را به ترتیب برای صفات تعداد غلاف در بوته (۷۸/۸۱%)، شاخه های اولیه (۱/۸۱%) وعملکرد دانه (۵/۷۹%) مشاهده کردند.

۲-۱۶-۶- ضریب تغییرات

از ضریب تغییرات برای تعیین دقت آزمایش و مقایسه طرحهای مختلف با یکدیگر و همچنین ارزیابی میزان تنوع ژنتیکی و فنوتیپی ایجاد شده، استفاده میشود [۴۱].
ضریب تغییرات ژنتیکی و فنوتیپی به عنوان معیار مناسبی برای ارزیابی تنوع حاصل از القاء جهش در مطالعات جهش به کار رفته است [۱۴۷]. مطالعه شیخ و همکاران [۱۴۴] روی نسل های M1 تا M4 حاصل از القاء جهش شیمیایی با EMS در خردل اتیوپیایی نشان داد که بیشترین تنوع حاصل از جهش با توجه به معیار ضریب تغییرات ژنتیکی و فنوتیپی به تعداد شاخه های ثانویه (۲/۲۹% ضریب تغییرات فنوتیپی و ۷/۲۵%ضریب تغییرات ژنتیکی) وکمترین آن به صفت روز تا رسیدگی اختصاص داشت. صدیقی و همکاران [۱۴۷] حداکثر میزان ضریب تغییرات را در صفات عملکرد دانه در بوته (۹/۳۷%)، تعداد غلاف در بوته (۳۰%) و وزن هزار دانه (۴/۲۸%) در موتانتهای کلزای حاصل از تیمار با اشعه گاما و اتیل متان سولفونات مشاهده کردند.

فصل سوم مواد و روشها

۳-۱- مکان آزمایش

این آزمایش در سال زراعی۹۱-۱۳۹۰ در مزرعه پژوهشی کشاورزی دانشگاه صنعتی اصفهان واقع در۴۰ کیلومتری جنوب غربی اصفهان اجرا شد. ارتفاع مزرعه از سطح دریا ۱۶۳۰ متر که دارای اقلیم نیمه خشک و خنک با تابستانهای خشک میباشد. میانگین بارندگی و دمای سالیانه به ترتیب۱۴۰ میلی متر و ۵/۱۴ درجه سانتیگراد می باشد. بافت خاک مزرعه لوم رسی با جرم مخصوص ظاهری ۴/۱ گرم بر سانتیمتر مکعب و میانگین pH آن حدود ۵/۷ است.

۳-۲- عملیات زراعی

زمین محل آزمایش در اسفندماه شخم و قبل از کشت دیسک زده شد. به منظور تأمین فسفر و ازت مورد نیاز گیاه، قبل از کاشت از فسفات آمونیوم به مقدار ۲۰۰ کیلوگرم در هکتار استفاده گردید. در تاریخ ۲۸/۱۲/۱۳۹۰ بذور هر لاین به صورت نواری بر روی یک ردیف به طول ۲ متر و با فاصله بین ردیف ۵۰ سانتیمتر و فاصله روی ردیف حدود ۵ سانتیمتر به عنوان یک واحد آزمایشی کشت گردیدند. آبیاری اول بلافاصله بعد از کشت و آبیاری های بعدی به طور تقریبی هر ۱۰-۷ روز یکبار انجام گردید. جهت تکمیل ازت مورد نیاز گیاه در مرحله به ساقه رفتن از کود اوره به صورت سرک و به میزان ۱۰۰ کیلوگرم در هکتار استفاده گردید. کنترل علف‌های هرز در آزمایش طی چتد مرحله به صورت دستی انجام گرفت. در مرحله پرشدن دانه‌ها جهت مقابله با شته کلزا از سم کنفیدور با غلظت cc5/0در لیتر استفاده گردید. هنگام برداشت نهایی نیز کل بوته‌های هر لاین برداشت گردید. اندازه گیری‌ها برای هر واحد آزمایشی به صورت میانگین ۵ بوته محاسبه گردید.

۳-۳- مواد ژنتیکی و طرح آماری مورد استفاده

مواد ژنتیکی مورد استفاده در این مطالعه شامل ۹۴ لاین نسل M3 حاصل از تیمار اشعه گاما بر روی ارقام ساریگل و RGS003 و همچنین ارقام والدینی بودند. این لاین‌ها از بخش دانه‌های روغنی موسسه اصلاح و تهیه نهال و بذر کرج تهیه شدند که بر اساس استاندارد توصیه شده [۸۷] با اشعه گاما در دزهای صفر(شاهد)، ۸۰۰، ۱۰۰۰ و ۱۲۰۰ گری پرتوتابی شده‌ بودند. عمل پرتوتابی با منبع کبالت ۶۰ سازمان انرژی اتمی در آبان ۱۳۸۶ انجام گرفته و پس از طی مراحل غربالگری در آزمایشگاه، به مدت دو سال در مزرعه کشت گردیده است [۳۸]. این لاین‌ها در قالب طرح مربع لاتیس ساده ۱۰×۱۰ در ۲ تکرار مورد ارزیابی قرار گرفتند. دو رقم مادری (شامل رقم RGS003 و رقم ساریگل) هر کدام با سه مرتبه کشت در هر تکرار بعنوان شاهد مورد استفاده قرار گرفت.

۳-۴- خصوصیات مورد بررسی و نحوه اندازه‌گیری آنها

روز تا ۵۰ % گلدهی: تعداد روز از تاریخ کاشت تا زمانی که ۵۰% بوته‌های هر واحد آزمایشی به گل رفتند.
روز تا رسیدگی: تعداد روز از تاریخ کاشت تا زمانی که حداقل ۵۰% غلاف‌ها در هر واحد آزمایشی قهوه ای شده باشند.
ارتفاع بوته: ارتفاع تعداد ۵ بوته تصادفی از محل طوقه تا بلندترین قسمت بوته بر حسب سانتی‌متر و پس از خاتمه گلدهی در ساقه اصلی اندازه گیری شد و میانگین آن ها منظور گردید.
تعداد غلاف در بوته: میانگین کل تعداد غلاف های ۵ بوته تصادفی (ساقه اصلی و شاخه های فرعی) اندازه گیری شد.
تعداد دانه در غلاف : میانگین تعداد دانه‌های موجود در ۵ غلاف از ۵ بوته تصادفی در هر لاین مورد محاسبه قرار گرفت.
وزن هزار دانه: برای تعداد ۵ نمونه از هر لاین با بهره گرفتن از سینی های شمارش بذر توزین شده و میانگین آن بر حسب گرم ثبت شد.
عملکرد دانه در بوته:بر اساس میانگین وزن دانه‌های به دست آمده از ۵ بوته تصادفی بر حسب گرم محاسبه گردید.

۳-۵- تجزیه آماری اطلاعات

تجزیه واریانس برای صفات مختلف بر اساس طرح آماری لاتیس ساده انجام گرفت و در صورت معنی دار بودن F، تیمارها به روش حداقل تفاوت معنی‌دار (LSD) مقایسه گردیدند. ضرایب همبستگی فنوتیبی و ژنتیکی بین صفات مورد محاسبه قرار گرفتند. از تجزیه رگرسیون مرحله‌ای به منظور تعیین صفاتی که بیشترین توجیه را در تغییرات عملکرد دانه داشتند، استفاده شد. با بهره گرفتن از نرم افزار Path analaysis نیز تجزیه ضرایب مسیر برای تعیین آثار مستقیم و غیر مستقیم اجزای عملکرد بر عملکرد دانه استفاده شد. جهت یافتن عوامل پنهانی، تجزیه به عامل‌ها به وسیله نرم افزار SAS انجام شد. اجزاء متشکله واریانس با بهره گرفتن از امید ریاضی میانگین مربعات طرح آماری برآورد گردید و سپس ضرایب تنوع فنوتیپی و ژنتیکی محاسبه گردید. برآورد وراثت پذیری عمومی صفات بر مبنای میانگین رقم محاسبه گردید. تجزیه آماری به کمک نرم افزارهای SAS، MSTATC، SPSS و ویرایش داده‌ها، ترسیم نمودارها و جداول به کمک نرم افزار Excel صورت گرفت.
جدول ۳-۱: امید ریاضی تجزیه واریانس طرح لاتیس ساده