تا حجم 100 میلی لیتر

آب

3-7-3- محلول­ها و بافر­های مورد نیاز جهت روش TUNEL، به ­منظور ارزیابی شکست DNA اسپرم
1- بافر شستشو: PBS
2- محلول تثبیت کننده: پارافرمالدهید 4 درصد در PBS (pH=7/4,Fresh)
3- محلول نفوذپذیرسازی: 1/0 درصد تریتونX100 در 1/0 درصد سدیم­سیترات(Fresh)
4- محلول^[57] PI 1درصد برای رنگ­آمیزی اسپرم­های سالم از نظر DNA

5- ترکیب واکنش کننده TUNEL: اضافه کردن 450 میکرولیتر از ویال محلول نوکلئوتید نشاندار به ویال محلول آنزیمی 50 میکرولیتری
3-7-4- مراحل انجام آزمایش TUNEL
1- تهیه اسمیر روی لام­ها و خشک کردن آن­ها در دمای اتاق
2- فیکس کردن لام­ها با محلول تثبیت کننده به مدت 1 ساعت در دمای اتاق
3- شستشو با PBS
4- پیپت کردن محلول نفوذپذیرسازی روی اسمیر و قرار دادن لام­ها به مدت 10 دقیقه در دمای 8-2 درجه سانتی ­گراد
5- شستشوی لام­ها در PBS(دوبار) و خشک کردن اطراف اسمیر
6- اضافه کردن 50 میکرولیتر از ترکیب واکنش کننده فعال به هر لام در تاریکی و انکوباسیون لام ها در انکوباتور 37 درجه
7- شستشو لام­ها در PBS (سه بار)
8- اضافه کردن رنگ PI
9- مشاهده زیر میکروسکوپ فلورسانس و شمارش حداقل 100 اسپرم و درصد­گیری (اسپرم­های سبز رنگ نشان­دهنده آسیب DNA می­باشد).
3-7-5- نحوه استفاده از کیت TUNEL
کیت TUNEL از شرکت Roche آلمان خریداری شده است. هر کیت قابلیت انجام 50 تست را داراست. دمای نگهداری کیت 15 تا 25 درجه سانتیگراد بوده و حساس به نور است. بنابراین باید در تاریکی نگهداری شود. کیت از 10 ویال که 5 عدد آن حاوی محلول نشانگر با درپوش بنفش رنگ و 5 عدد باقیمانده حاوی آنزیم TDT^[58] با درپوش آبی می­باشد، تشکیل شده است. محلول آنزیمی، وظیفه شناسایی شکستگی­های موجود در دو رشته DNA، از طریق انتهای آزاد 3´OH را بر عهده دارد. محلول نشانگر، یک نشانگر فلورسنت پلیمرهای نوکلئوتیدی است که به وسیله میکروسکوپ فلورسنت تشخیص داده می­ شود.
3-8- بررسی بیان ژن Kdm5d یا Smcy
ابتدا با روش RT-PCR و سپس با روش Real-Time PCR بيان ژن مورد مطالعه، ارزيابي شد. نام ژن مورد نظر و توالی پرايمر مورد استفاده در جدول3-3 آمده است که با بهره گرفتن از نرم افزار Perl Primer طراحی شد و برای اطمینان از پرایمر مربوطه توسط نرم افزار Gene Runner هم چک شد.
جدول (3-3): ژن مورد نظر و توالی پرايمر مورد استفاده(که توسط نگارنده طراحی شده است)

نام ژن مورد نظر

(5′ 3′) توالی پرایمر

Gapdh

FOR: 5´GACTTCAACAGCAACTCCCAC 3´
REV: 5´TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3´

Kdm5d

FOR: 5´ACT TGT CAC TCT GAT GAA TCC T 3´
REV: 5´TCC AAC AGG TAG CCA ATC G 3´

3-8-1- استخراج RNA به روش ترایزول
استخراج RNA در سه مرحله، زیر هود شیمیایی و روی یخ انجام شد. برای جلوگیری از آلودگی با DNA و احتمال از دست رفتن RNA، از ویال­های DNase-RNase free و سرسمپلرهای فیلتردار استفاده گردید.
مراحل کار به شرح ذيل مي‌باشد:

• ابتدا نمونه از فریزر خارج شد و پس از ذوب شدن یخ نمونه، از داخل میکروویال خارج و در پتری دیش قرار داده شد. با بهره گرفتن از یک تیغ استریل جراحی، به دقت نمونه­ بافتی خرد شده و در یک ویال فاقد نوکلئاز قرار داده شد.

• به ازای هر 50 تا 100 میلی گرم از بافت، یک میلی لیتر ترایزول به ویال اضافه شد تا بافت هموژنیزه گردد. پس از اضافه کردن ترایزول، در صورتی­که بافت هنوز باز نشده باشد، با پنس استریل نمونه­های بافتی مجددا خرد شده و تا زمان بازشدن کامل بافت، با سمپلر به آرامی پیپت شود. پس از اینکه بافت کاملا باز شد، نمونه به مدت 5 دقیقه در دمای آزمایشگاه (25 درجه)، قرار داده شد تا جداسازی کمپلکس نوکلئوپروتئینی به طور کامل انجام شود.