۳-۱۰-۱- اندازه‌گیری پارامترهای رشدی
پس از اینکه نمونه‌های گیاهی از مزرعه جمع آوری شدند، بلافاصله نمونه‌ها به آزمایشگاه منتقل شدند و وزن تر آن‌ها برحسب گرم توسط ترازوی آزمایشگاهی دیجیتال با دقت یک صدم گرم اندازه‌گیری و ثبت گردید. پس از اندازه‌گیری وزن تر، نمونه‌ها را در اتاقی با دمای خنک و در معرض سایه، خشک کرده، سپس وزن خشک آن‌ها در آزمایشگاه اندازه‌گیری شد.سپس، عملکرد وزن تر و خشک در هر تیمار برحسب گرم محاسبه شد. اندازه‌گیری ارتفاع گیاه و طول میانگره نیز با خط کش و در مرحله گلدهی کامل، صورت گرفت. نمونه‌های خشک شده را در پاکت‌های کاغذی بسته‌بندی کرده و تا زمان استخراج ماده مؤثره در جای خشک و خنک نگهداری شدند.
۳-۱۰-۲- استخراج اسانس
عمل استخراج اسانس به روش تقطیر با آب[۲۲] و توسط دستگاه کلونجر[۲۳] در آزمایشگاه گیاهشناسی انجام گرفت. برای این کار صد گرم از پودر گیاه خشک شده پس از توزین در یک بالون ته گرد یک و نیم لیتری ریخته و سپس مقداری آب مقطر (حدود دو سوم حجم بالن) به آن اضافه نموده و بالن را به دستگاه کلونجر متصل کرده تا عمل تقطیر به مدت سه ساعت انجام شود. سپس درصد اسانس مربوط به هر نمونه اندازه‌گیری و تعیین شد.
۳-۱۰-۳- رطوبت‌گیری اسانس‌ها
پس از استخراج اسانس، با بهره گرفتن از سولفات سدیم بی آب اسانس‌ها را آب گیری نموده و در ظروف در بسته شیشه‌ای تیره رنگ، دور از نور و در یخچال با دمای ۴ درجه سانتی گراد نگهداری شدند. میزان مصرف سولفات سدیم بدون آب، ۱/۰ گرم به ازاء هر سی سی حجم اسانس بود. به این صورت که بعد از اضافه کردن سولفات سدیم به میزان ذکر شده از اسانس، آن را به شدت تکان داده تا به طور کامل مخلوط شود. بعد از چند ثانیه که ذرات سولفات سدیم آب موجود در اسانس را جذب کردند، به صورت ذرات ریز سفید رنگ در ته ظرف ته نشین شدند. پس از جداسازی اسانس، سولفات سدیم آبدار حذف گردید.
۳-۱۱- آنالیز اسانس
به منظور جداسازی و شناسایی ترکیبات اسانس از دستگاه کروماتوگرافی گازی و کروماتوگرافی متصل به طیف سنج جرمی در آزمایشگاه شهید بهشتی تهران استفاده شد. برای آماده‌سازی نمونه‌ها با سولفات سدیم رطوبت‌گیری شدند، زیرا رطوبت موجود در نمونه به ستون دستگاه کروماتوگراف صدمه می‌زند.
نمونه‌های آماده شده به دستگاه کروماتوگرافی تزریق شده و مناسب‌ترین برنامه‌ریزی‌های ستون برای جداسازی کامل ترکیب‌های اسانس بهدست آمد. همچنین درصد ترکیب‌های تشکیل دهنده هر اسانس و عدد کواتز هر ترکیب محاسبه گردید. سپس اسانس‌ها به دستگاه گاز کروماتوگراف متصل به طیف سنج جرمی نیز تزریق شد و طیف جرمی ترکیب‌ها بهدست آمد. شناسایی ترکیبات اسانس با بهره گرفتن از پارامترهای مختلف از قبیل زمان و شاخص بازداری، مطالعه طیف‌های جرمی و مقایسه این طیف‌ها با ترکیب‌های استاندارد و اطلاعات موجود در کتابخانه‌ی رایانه دستگاه GC-MS صورت گرفت. درصد نسبی هر کدام از ترکیبات تشکیل دهنده‌ی اسانس با توجه به سطح زیر منحنی آن در کروماتوگرام GC به روش نرمال کردن سطح[۲۴] و نادیده گرفتن ضرایب پاسخ[۲۵] بدست آمد.
۳-۱۱-۱- مشخصات دستگاه‌های مورد استفاده
۳-۱۱-۱-۱- مشخصات دستگاه کروماتوگرافی گازی (GC)
کروماتوگراف گازی مدل Trace GC ساخت شرکت ThermoQuest-Finnigan مجهز به آشکارساز FID (یونیزاسیون شعله هیدروژن) با ستون DB-5 به طول ۳۰ متر، قطر داخلی ۲۵/۰ میلی‌متر و ضخامت لایه فاز ساکن ۲۵/۰ میکرون بود. برنامه‌ریزی حرارتی آون، از ۶۰ تا ۲۵۰ درجه سانتی‌گراد با سرعت افزایش ۵ درجه سانتی‌گراد در دقیقه انجام گردید. گاز حامل نیتروژن، با مقدار جریان ۱/۱ میلیلیتر بر دقیقه بود. نسبت شکاف ۱:۵۰، برای رقیق کردن نمونه استفاده شد. دمای محفظه تزریق ۲۵۰ درجه سانتی‌گراد و دمای آشکارساز ۲۸۰ درجه سانتی‌گراد محاسبه گردید. حجم نمونه اسانس تزریق شده به دستگاه نیز ۲/۰ میکرو لیتر بود.
۳-۱۱-۱-۲- مشخصات دستگاه کروماتوگرافی متصل به طیف سنج جرمی (GC-MS)
برای آنالیز اسانس از دستگاه کروماتوگراف کوپل شده با طیف سنج جرمی مجهز به ستون DB-5 به طول ۲۵/۰ میلی‌متر و ضخامت لایه نازک ۲۵/۰ میکرومتر استفاده شد. دمای آون از ۶۰ درجه سانتی گراد تا ۲۵۰ درجه سانتی گراد با سرعت ۴ درجه سانتی گراد بر دقیقه افزایش یافت و به مدت ۱۰ دقیقه در ۲۵۰ درجه سانتی گراد نگه داشته شد. از گاز حامل هلیوم با سرعت جریان ۱/۱ میلیلیتر بر دقیقه استفاده شد و از انرژی یونیزاسیون ۷۰ الکترون ولت استفاده گردید.
۳-۱۲- محاسبات آماری
قبل از تجزیه و تحلیل داده‌ها آزمون نرمال بودن داده‌ها با بهره گرفتن از نرم افزارMinitab انجام شد. تجزیه واریانس داده‌ها با بهره گرفتن از نرم افزار آماری SAS انجام شد و برای ترسیم نمودارها از نرم افزار Excel استفاده شد. مقایسه میانگین با نرم افزار MSTATC (با بهره گرفتن از مقایسه میانگین دانکن) صورت گرفت.
فصل چهارم
نتایج و بحث
۴-۱- نتایج
نتایج حاصل از تجزیه واریانس داده ها نشان داد که تیمار اسید سالییلیک و فاصله کشت اثر معنیداری بر صفات مورد ارزیابی در این آزمایش شامل وزن تر و خشک بوته، قطر بوته، ارتفاع بوته، طول میانگره، بازدهی اسانس و درصد ترکیبات اسانس دارد.
| جدول۴- ۱- نتایج تجزیه واریانس صفات مورد بررسی در گیاه مرزه بختیاری تحت تاثیر تراکم و اسید سالیسیلیک | ||||||
| بازدهی اسانس | طول میانگره | ارتفاع بوته | قطر بوته | وزن خشک بوته | وزن تر بوته | منابع تغییرات |
| ۰۴۶/۰ | ۰۰۱۱/۰ | ۸۰ | ۲۵/۱۱ | ۸۹/۴ | ۱۰۵ | بلوک |
| **۰۳۷/۰ | ||||||
