برای تهیه ۱۰۰ میلی لیتر بافر CTAB مقادیر موادی که در جدول ۳-۴ آورده شده است را تهیه کرده و با آب مقطر حجم آن به ۱۰۰ میلی لیتر رسانده شد.
جدول ۳-۴- مقادیر و نوع مواد مورد نیاز برای تهیه ۱۰۰ میلی لیتر بافر CTAB
| مقدار(گرم) | مواد مورد نیاز |
| ۰.۱۲ | Tris-HCl |
| ۰.۸۱ | NaCl |
| ۰.۰۷ | EDTA |
| ۰.۴ | CTAB |
۳-۴-۲- تهیه کلروفرم- ایزوآمیل الکل
جهت تهیه کلروفرم- ایزوآمیل الکل این دو ماده با نسبت ۱:۲۴ با یکدیگر مخلوط شدند.
۳-۵- استخراج RNA از بافت
استخراج RNA با بهره گرفتن از کیت دنازیست انجام شد. قبل از شروع آزمایش، آب تیمار شده با DEPC و همچنین تمام وسایل مورد نیاز برای استخراج RNA دو مرتبه و بیشتر اتوکلاو گردید. مراحل استخراج طبق دستورالعمل مخصوص کیت دنازیست به شرح ذیل انجام شد:
۱- بافت گیاه داخل هاون چینی سترون ریخته و به آن ازت مایع اضافه گردید و کاملا پودر شد.
۲- مقدار ۱۰۰ میلی گرم بافت کوبیده شده برداشت شد.
۳- ۱ میلی لیتر بافر شماره یک G1 به ویال اضافه و ورتکس نموده تا کاملا یکنواخت شود.
۳- نمونه ۵ دقیقه در دمای محیط قرار داده شد.
۴- سانتریفوژ×g 12000 به مدت ۱۰ دقیقه با دمای ۴ درجه سانتیگراد انجام گردید.
۵- با بهره گرفتن از میکروپیپت محلول رویی را به آرامی جدا نموده، ۲۰۰ میکرولیتر کلروفرم به آن اضافه کرده و ۳۰ ثانیه وارونه نموده تا شیری رنگ شود. سپس ۳ دقیقه در دمای محیط نگهداری شد.
۶- سانتریفوژ×g 12000 به مدت ۱۵ دقیقه با دمای ۴ درجه سانتیگراد انجام گردید.
۷- از محلول رویی مقدار ۴۵۰-۴۰۰ میکرولیتر با بهره گرفتن از میکروپیپت به آرامی برداشته شد.
۸- هم حجم آن بافر شماره دو G2 و نصف حجم آن ایزوپروپانول سرد اضافه گردید و پس از چند مرتبه وارونه کردن، به مدت ۱۰ دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد.
۱۰- پس از ۱۰ دقیقه سانتریفوژ با نیروی×g 10000 و دمای ۴ درجه سانتیگراد، فاز رونشین حذف و رسوب حاصله با یک میلی لیتر اتانول ۷۰ درصد و یک مرحله سانتریفوژ) ۵ دقیقه در×g 10000 و دمای ۴ درجه سانتیگراد) شستشو داده شد.
۱۳- پس از حذف اتانول، رسوب با ۱۵-۱۰ دقیقه هوادهی خشک و سپس در ۴۰ میکرولیتر آب تیمار شده با DEPC حل و بلافاصله در فریزر با دمای ۸۰- درجه سانتیگراد قرار داده شد.
۳-۵-۱-تهیه آب تیمار شده با DEPC
مقدار ۱ در هزار ماده DEPC به آب دو مرتبه تقطیر در زیر هود اضافه گردید. به مدت یک ساعت و هر ۱۵ دقیقه یکبار محلول هم زده شد و سپس دو مرتبه اتوکلاو گردید.
۳-۵-۲- تعیین کمیت و کیفیتRNA
با بهره گرفتن از دستگاه نانودراپ، غلظت RNA استخراج شده بر حسب و میزان خلوص آن با بهره گرفتن از نسبت جذب نور محاسبه و در نهایت برای اطمینان از کیفیت RNA استخراج شده روی ژل آگارز % ۱ الکتروفورز شد.
۳-۵-۳- تیمار DNase
تیمار DNase با بهره گرفتن از کیت فرمنتاز و دستور العمل مربوطه برای حذف آلودگی ژنومی از آموده RNA استخراج شده انجام شد. مواد مورد نیاز طبق جدول ۳-۵ بر روی یخ با هم مخلوط شده و حجم واکنش با آب تیمار شده با DEPC به ۲۰ میکرولیتر رسانده شد و به مدت ۳۰ دقیقه در دمای C° ۳۷ داخل دستگاه ترموسایکلر قرار داده شد (جدول ۳-۵).
جدول ۳-۵- نوع و مقدار مواد مورد نیاز برای تیمار DNase
| مقدار مورد نیاز | نوع ماده |
