Components
۱۰۰ml
Phosphoric acid85%
۱
۵۰ml
Ethanol 95%
۲
۷۵۰ml
distilled water
۳
۱۰۰mg
Coomassie blueG-250
۴
بعد از تهیه محلول فوق، به وسیله کاغذ واتمن فیلتر گردید و در یک ظرف تیره رنگ نگهداری گردید.
۳-۸-۲-۲-۳. روش کار
۱۰۰ میکرولیتر از هر نمونه مجهول با ۱۰۰ میکرولیتر ازNaOH 1 مولار به خوبی مخلوط گردید.
بعد به آن ۵ میلیلیتر از محلول برادفورد اضافه گردید و دوباره به خوبی مخلوط گردید.
برای تهیه نمونه شاهد، ۱۰۰ میکرولیتر آب مقطر با ۱۰۰ میکرولیتر از NaOH 1 مولار مخلوط گردیده، و به آن ۵ میلیلیتر از محلول برادفورد اضافه گردید.
آنها به مدت ۵ دقیقه در دمای محیط انکوبه گردیدند.
پس از انکوباسیون، شاهد در کوت ریخته میشد و داخل دستگاه اسپکتروفتومتر قرار داده شد (طول موج nm595) و سپس دستگاه با این محلول صفر گردید.
هر کدام از نمونههای فوق در کوت ریخته شد و داخل دستگاه اسپکتروفتومتر قرار گرفتند و عدد قرائت گردید.
سپس از فرمول زیر غلظت پروتئینهای هر نمونه محاسبه گردید:
غلظت نمونه غلظت استاندارد
۳-۹. الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید (تک بعدی)
در این نوع الکتروفورز پروتئینها بر اساس وزن مولکولی از هم تفکیک گردیدند.
۳-۹-۱. مواد مورد نیاز
منومراکریلآمید۱۰%، ۱.۵ Tris-HCL و ۰.۵ مولار، SDS، آمونیوم پرسولفات۱۰%، TEMED، Loading Buffer، Running Buffer، رنگآمیزی کوماسی بلو R-250 (محلول رنگآمیزی، محلول رنگبری) رنگآمیزی Blue Silver Staining (محلول تثبیت و محلول رنگآمیزی) و آب دوبار تقطیر
۳-۹-۲. آماده سازی مواد
منومراکریلآمید۱۰%: ۱۴۶ گرم از اکریلآمید با ۸/۰ از N-N-bis-metylen-acrylamid به ۵۰۰ میلیلیتر آب مقطر استریل اضافه گردید و با کاغذ واتمن، استریل شد.
Tris-HCL1.5 M, PH8.8: 54 گرم Trisbase با وزن مولکولی ۱۲۱ به ۳۰۰ میلیلیتر آب مقطر اضافه شد و در ۴ درجه سانتی گراد قرار گرفت.
Tris-HCL0.5 M, PH6.8: 5گرم Trisbase به ۱۰۰ میلیلیتر آب مقطر اضافه گردید.
Loading Buffer: 25/1 میلیلیتر Tris-HCL 0.5 M, PH6.8به ۵/۲ میلیلیتر گلیسرول اضافه گردید و سپس به آن ۲ میلیلیتر SDS10% و ۲/۰ میلیلیتر بروموفنول ۵% اضافه گردید و در نهایت ۵۵/۳ میلیلیتر آب مقطر به آن اضافه شد و قبل از استفاده به آن ۲۰ میکرولیتر از ۲-مرکاپتواتانول اضافه شد و حل گردید.
Running Buffer: این بافر طبق جدول زیر آماده گردید. PH بافر روی ۳/۸ تنظیم گردید (Rosenberg J.M., 2005).
جدول ۳-۵: مواد تشکیلدهنده Running Buffer10%
۱Lit
Components
۳۰.۳g
Tris base
