Real-time PCR یک روش سریع و آسان با اختصاصیت و حساسیت بالا و با دامنه وسیعی از کاربردها می باشد. این تکنولوژی یک روش اندازه گیری سریع، اختصاصی و کمی از ژن ها این است که در تشخیص بیماری های عفونی، سرطان و ناهنجاری های ژنتیکی را میسر می سازد (۱۴).
۱-۱۱-۲: مزایای روش Real-time PCR:
در این روش تکثیر در هر زمان قابل مشاهده می باشد. به عبارتی امکان مانیتورینگ لحظه به لحظه واکنش فراهم آمده و در هر سیکل امکان بررسی فرایند تکثیر وجود دارد. همچنین امکان بهینه سازی واکنش وجود دارد. به طوری که مناسب ترین غلظت DNA و پرایمر و همچنین تعداد سیکل لازم برای تکثیر مشخص می‌شود.

امکان قطع واکنش در زمان دلخواه در این روش وجود دارد. از آنجایی که روند PCR قابل مشاهده می باشد، در صورت عدم تکثیر و یا رفتن به فاز سکون^[۳۲] می توان به واکنش خاتمه داد و از اتلاف وقت و انرژی پرهیز نمود.
محدوده تشخیص در این روش بالاتر از PCR معمولی است تا حدی که اختلاف کمتر از ۲ برابر را هم نشان می دهد.
در این روش با بهره گرفتن از Absulute Quantification و Relative Quantification میزان دقیق و نسبی الگوی اولیه قابل اندازه گیری است.
۱-۱۱-۳: انواع روش های Real-time PCR:
به طور کلی دو روش برای انجام PCR کمی با روش Real-time PCR داریم:
۱: نوع غیر اختصاصی: که با بهره گرفتن از عوامل متصل شونده به DNA مثل SYBRGreen به انجام می رسد.
این رنگ به DNA از طریق جایگزینی در شیار کوچک DNA متصل می شود. از جمله مزایای این روش ارزان، راحت و حساس بودن آن است. یکی از معایب بزرگ آن این است که با اتصال به دو رشته ای هایی مثل پرایمر دایمر و دیگر باندهای غیر اختصاصی، نتایج کمی بیشتر از غلظت اصلی برآورد می شوند و بنابر این اپتیمایز کردن آن باید به گونه ای باشد که حداقل پرایمر دایمر و محصول غیر اختصاصی ایجاد گردد. برای تایید نتایج از آنالیز منحنی ذوب (Melt Curve Analysis) استفاده می شود.

شکل ۱-۱۱: در واکنش PCR در هنگامی که DNA به صورت واسرشت است سایبر گرین به DNA متصل نمی باشد. در مرحله اتصال و تکثیر DNA ، همزمان با دو رشته ای شدن DNA سایبر گرین در ساختار DNA قرار می گیرد. و با افزایش DNA های دو رشته ای مقدار سایبر گرین متصل شده نیز افزایش می یابد و در نتیجه نور فلورسانت بیشتری ساطع می‌شود.
شکل۱-۱۲: مکانیسم عمل SYBR Green به عنوان عامل متصل شونده به DNA
۲: نوع اختصاصی: نوع اختصاصی Real time PCR با پروب های اولیگونوکلئوتیدی اختصاصی انجام می شود که با دو نشانگر رنگی فلورسنت reporter و quencher در ابتدا و انتها تجهیز شده اند. پروب های متفاوت بر اساس خواص شیمیایی در دسترس می باشند از قبیل Taqman و Beacons .
۱-۱۱-۴: روش های تعیین کمیت با Real-time PCR:
یکی از مهمترین کاربردهای Real-time PCR تعیین کمی مقدار ژن بیان شده است که به دو روش صورت میگیرد:
۱: (Absolute Quantification) کمیت سنجی مطلق
۲: (Relative Quantification) کمیت سنجی نسبی
۱-۱۱-۴-۱: Absolute Quantification :
در کمیت سنجی مطلق تعداد دقیق کپی از یک ژن (copy number) مشخص می گردد در حالی که در کمیت سنجی نسبی ، نسبت بیان یک ژن به ژن دیگر یا به عبارتی تغییرات کمی در بیان یک ژن اعلام می شود.
برای تعیین دقیق کپی های یک ژن(Copy Number) به منحنی استاندارد نیاز می باشد. منحنی استاندارد را براساس مقدار معلوم همان ژن و Threshold Cycle هر نمونه رسم می کنیم.
۱-۱۱-۴-۲: چگونگی رسم یک منحنی استاندارد:
یک سری رقت (Serial Dilution) از نمونه استاندارد تهیه کرده و برای تمامی رقت ها واکنش PCR انجام می شود. از روی نمودار تکثیر Ct نمونه ها مشخص می شود .سپس منحنی استاندارد آنها بر اساس Ct در محور Yها و Log تعداد کپی در محور X ها رسم می شود. شود.این منحنی خطی است با شیب منفی که دارای یک معادله است. حال با دانستن Ctنمونه مجهول (که برای آن همراه با نمونه های استاندارد PCR انجام شده است ) و قراردادن آن در معادله منحنی استاندارد تعداد کپی آن مشخص می شود (شکل۱-۱۳).
شکل۱-۱۳: رسم منحنی استاندارد نشان داده شده است. با دانستن Ct نمونه مجهول و قرار دادن آن در معادله منحنی استاندارد تعداد کپی آن مشخص می شود.
دقت و تعیین کمی ژن بیان شده موردنظر کاملاً به درستی وحساسیت منحنی استاندارد بستگی دارد، به این دلیل باید در تعیین میزان کمی نمونه های استاندارد (Copy Number) دقت فراوانی مبذول داشت. تعداد Template ها در نمونه های استاندارد می تواند بین محدودۀ ۱۰^۱ تا ۱۰^۱۰ مولکول باشد.
۱-۱۱-۴-۳: Relative Quantification
یکی از کاربردی ترین استفاده های Real-time PCR بررسی بیان ژن هاست که با بهره گرفتن از کمیت سنجی نسبی انجام می شود. در حال حاضر کمیت سنجی، دقیق ترین روش برای بررسی تغییرات بیان ژن است. در این روش تعدا مهم نیست و فقط کاهش یا افزایش بیان ژن مهم می باشد، که این کاهش یا افزایش را با یک استاندارد یا ژن مرجع مقایسه می کنند. این ژن عموما یک House Keeping Gene می باشد.
در کمیت سنجی نسبی لزومی به دانستن غلطت دقیق نمونه ها نیست. این روش هم از نظر اقتصادی و هم از نظر زمانی مقرون به صرفه می باشد.
اساس کمیت سنجی نسبی بر پایه نسبت بیان ژن مورد نظر به ژن مرجع است.
در کمیت سنجی نسبی آنچه مهم است بازده PCR می باشد در صورتی که کمیت سنجی مطلق نمودار استاندارد حائز اهمیت است.
۱-۱۱-۵: کاربرد های Real-time PCR:
- مطالعات کمی بیان mRNA
- اندازه گیری تعداد کپی ژن در DNA ژنومی یا ویروسی
- آزمون افتراق اللی یا تعیین ژنوتایپ از طریق SNP^[33] ها
- تایید نتایج میکرواری^[۳۴]
- تعیین اثر بخشی در دارو درمانی
- اندازه گیری آسیب DNA
- شناسایی و تعیین Load عوامل عفونی
- بررسی سرطان های خونی و تعیین ریسک بازگشت آنها
- و چندین کاربرد دیگر برای Real-time PCR قابل برنامه ریزی و انجام است
۱-۱۲: بیان مساله
هموفیلوس آنفلونزا (Hi) یک باکتری گرم منفی، منحصراً پاتوژن انسانی است که عامل عفونت های گوناگونی هم چون مننژیت، اپی گلوتیت، پنومونی، سلولیت، باکتریمی، آرتریت عفونی و عفونت ملتحمه چشم است. در کشورهای همسایه ایران مثل کویت و عربستان نزدیک به نیمی از مننژیت های باکتریال کودکان بوسیله هموفیلوس آنفلونزا ایجاد می شوند. ویرولانس این باکتری وابسته به حضور و یا عدم حضور کپسول و همچنین نوع آن می­باشد. شش سروتیپ اصلی از هموفیلوس آنفلونزا شناسایی شده اند که از a تا f نام گرفته اند. تقسیم بندی آنها بر اساس تفاوت آنتی ژنی در کپسولهای پلی ساکاریدی آنها صورت می گیرد. تیپ b هموفیلوس آنفلوانزا یکی از مهمترین عوامل ایجاد کننده مننژیت در کودکان زیر ۵ سال در سراسر جهان می باشد. این تیپ باعث ایجاد تشنج و عقب ماندگیهای ذهنی در افراد غیر ایمن می گردد. مهمترین عامل ویرولانس و ایمنی زائی این باکتری کپسول پلی ساکاریدی آن است که از پلی مر (PRP) ساخته شده است. از آنجایی که PRP نقش اصلی در ویرولانس را ایفا می کند و یکی از اجزای اصلی واکسن تهیه شده بر علیه این باکتری PRP خالص از تیپ b می باشد ، انتخاب و جداسازی باکتری که میزان PRP بالایی داشته باشد در اولویت کارهای تحقیقاتی جهت تولید این واکسن میباشد. ژنهای مسئول تولیدPRP برجایگاه تولید کپسول (cap locus) قرار دارند و اغلب نمونه های هموفیلوس آنفلونزا b دارای چند کپی از این جایگاه هستند و هر چه تعداد این جایگاه ها بیشتر باشد قابلیت تولید PRP بیشتر گزارش شده است (۳،۵،۶۶).
روش های معمول برای تشخیص این باکتری شامل کشت های باکتریولوژیک و روش های بیوشیمیایی و شمارش سلول در مایع مغزی نخاعی از حساسیت بالایی بر خوردار نیست. بنابر این یافتن یک روش سریع و دقیق جهت تشخیص انواع کپسوله و غیرکپسوله این باکتری مثل روش PCR , از ضرورتهای امروز است (۴۷،۳۰،۳۳،۴۹).
۱-۱۳: ضرورت انجام تحقیق
انتخاب یک سویه محلی قابل اطمینان که شرایط یک سویه واکسینال را داشته باشد و بالاترین تولید پلی ساکاریدی را در بین سویه ها داشته باشد از نظر اقتصادی اهمیت بسیاری دارد. از آنجایی که هدف تهیه یک سویه واکسینال مناسب بومی می باشد ، نیاز است که تمام خصوصیات میکروبیولوژی و بیوشیمیایی و مولکولی این باکتری از تمام زوایا مشخص و ثبت گردد .