۲-۳-۲-۲-۲- بررسی تعداد اسپرم
برای شمارش اسپرم ها از MAKLER CHAMBER استفاده شد . نمونه هایی که غلظت اسپرم در آنها از بیست میلیون در میلی لیتر کمتر بود از مطالعه حذف شدند. بعد از شستشو به روش Swim-up مستقیم نیز شمارش اسپرم انجام شد.

۲-۳-۲-۲-۲-۱- روش استفاده از MAKLER CHAMBER برای شمارش
برای شمارش، μl10 از نمونه، توسط سمپلر روی قسمت وسط MAKLER CHAMBER قرار داده می شود و سپس لامل آن روی نمونه قرار می گیرد، این لامل از ۱۰۰ خانه ۱۰×۱۰ تشکیل شده است و با بزرگنمایی X20، تعداد اسپرم های موجود در ۱۰مربع عمودی پشت سرهم و یا ۱۰ مربع افقی پشت سر هم را شمارش می شود و یا میانگین این دو گرفته می شود سپس عدد به دست آمده ضرب در ۱۰^۶ می شود تا تعداد اسپرم در یک میلی لیتر برحسب میلیون به دست آید .عدسی با بزرگنمایی ۲۰ باید مخصوص برای MAKLER CHAMBER باشد(WHO 2010).
۲-۲- MAKLER CHAMBERبرای شمارش اسپرم استفاده می شود
۲-۳-۲-۲-۳- ارزیابی تحرک
بر اساس استاندارد WHO وقتی نمونه انزالی در محدوده طبیعی قرار می گیرد که حرکت پیشرونده^[۸۱] (a+b) در بیشتر از ۵۰ درصد و حرکت سریع^[۸۲] (a) در بیش از ۲۵ درصد اسپرم ها مشاهده گردد. تعداد اسپرم در هر میلی لیتر از منی حداقل باید ۲۰ میلیون اسپرم باشد. از آنجا که کمترین حجم نرمال مایع سمینال ۲ میلی لیتر می باشد، بنابراین تعداد کل اسپرم در هر مرتبه از انزال افراد بارور حدود ۴۰ میلیون اسپرم می باشد.
۲-۳-۲-۲-۳-۱- روش کار
۱-برای مشاهده تحرک اسپرم ۱۰ میکرولیتر از سیمن مایع توسط سمپلر برداشته می شود.
۲- نمونه را بر روی MAKLER CHAMBER قرار داده و با لامل پوشانده می شود.
۳- با بهره گرفتن از میکروسکوپ نوری و با بزرگنماییX20 ، انواع حرکت اسپرم ها بررسی می شود.
۴- تعداد اسپرم های دارای حرکت سریع پیشرونده و (a)، آهسته پیشرونده^[۸۳] (b)، حرکت درجا^[۸۴]©، واسپرم های بیحرکت^[۸۵](d) را در مربع های مختلف MAKLER CHAMBER مشاهده وبا کانتر شمار ش می شود تا به صد برسد تا به صورت درصد بیان شود. برای هر نمونه قبل و بعد از شستشو به روش Swin-up Direct نتایج ثبت شد(WHO 2010).
۲ -۳- شکل لامل MAKLER CHAMBER که به صورت ۱۰×۱۰ مدرج شده است.
۲-۳-۲-۲-۴- ارزیابی قابلیت حیات
طبق استاندارد WHO اگر در نمونه انزالی ۵۰ درصد یا بیشتر از اسپرم ها زنده باشند، نمونه مورد نظر در محدوده ی طبیعی قرار داده می شود که تقریباً معادل همان درصد تحرک اسپرم ها ست. هر اسپرم متحرک یعنی اسپرم زنده. این تست در نمونه هایی که دارای تحرک کم می باشند دارای ارزش بیشتری است. ارزیابی قابلیت حیات با تست های مختلف رنگ آمیزی انجام می گیرد، مثل رنگ آمیزی ائوزین و ائوزین-نیگروزین که در این تحقیق از رنگ آمیزی ائوزین- نیگروزین استفاده شد.
۲-۳-۲-۲-۴-۱- روش کار رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین
۱-۱۰میکرولیتر رنگ ائوزین-نیگروزین با سمپلر برداشته و درون یک میکروتیوپ ریخته می شود.
۲-۱۰میکرولیتر نمونه با سمپلر برداشته و درون میکروتیوپ حاوی رنگ ریخته می شود و با عمل پیپتینگ^[۸۶] با ائوزین-نیگروزین مخلوط می شود و ۳۰ ثانیه وقت داده می شود.
۳- سپس ۱۰ میکرولیتر از آن را با سمپلر برداشته روی لام گذاشته می شود و به وسیله ی لام دیگری از این اسمیر تهیه می شود تا خشک شود.
۴- بعد توسط میکروسکوپ نوری مشاهده می شود، بهتر است با بزرگنمایی X 100 بررسی شود. اسپرم هایی که رنگ را به خود گرفته اند و قرمز یا صورتی شده اند مرده و آنهایی که سر سفید دارند و رنگ را به خود نگرفته اند زنده اند.
تعداد۱۰۰ اسپرم شمرده می شود. نتایج در قبل و بعد از شستشو به روش Direct swim up ثبت گردید(WHO 2010).
B
A
۲-۳-۲-۲-۵- ارزیابی مورفولوژی
طبق استاندارد WHO ، اگر در نمونه انزالی ۳۰% یا بیشتر از اسپرم ها مورفولوژی طبیعی داشته باشند نمونه در محدوده ی طبیعی قرار داده می شود. برای تعیین مورفولوژی اسپرم از روش رنگ آمیزی پاپانیکولا^[۸۷] طبق دستور WHO انجام شد.باید ۱۰۰ اسپرم با بزرگنمایی ۱۰۰ بعد از رنگ آمیزی مطالعه کرد تا بتوان انواع طبیعی را از انواع غیر طبیعی مشخص نمود، تا درصد مورفولوژی نمونه گزارش شود. طیف اشکال غیر طبیعی اسپرم بسیار وسیع است. اشکال غیر طبیعی اسپرم عبارتنداز: اسپرم های دارای دوسر، سر بزرگ، سر کوچک، سر گرد و بدون آکروزوم، سر سنجاقی، اسپرم ها یی با دم های غیر طبیعی بلند یا کوتاه، دو دم، بدون دم، دم پیچ خورده یا زوائد سیتوپلاسمی در ناحیه قطعه میانی وگردن است.
۲-۳-۲-۲-۵-۱- رنگ آمیزی پاپانیکولا
این نوع رنگ آمیزی رنگ آمیزی خوبی برای اسپرم ودیگر سلول ها می باشد. باعث رنگ شدن آکروزوم و بعد از آکروزوم ، قسمت سر و قطعه میانی می شود که سر رنگ آبی و قطعه میانی به رنگ قرمز یا صورتی در می آید. جهت بررسی مورفولوژی نمونه، ابتدا از هر نمونه یک لام فیکس می شود تا بعداً به طور یک جا رنگ آمیزی پاپانیکولا روی آنها انجام می شود. برای هر نمونه یک لام قبل از عمل Swim-up و یک لام بلافاصله بعد از عمل Direct Swim-upبه صورت فیکس شده از اسپرم تهیه شد.
۲-۳-۲-۲-۵-۲- روش فیکس کردن
۱-۱۰ میکرولیتر از سیمن را توسط سمپلر برداشته و روی لام قرار داده می شود.
۲-به وسیله ی لام دیگری از آن اسمیر تهیه می شود و اجازه داده می شود در محیط خشک شود. از لام هایی که در کناره دارای برچسب هستند استفاده می شود تا بتوان لام ها را با مداد شماره گذاری کرد، به عنوان مثال نحوه ی شماره گذاری لام ها به این صورت بود: b1(نمونه شماره یک قبل ازDirect Swim-up ) و a1 (نمونه شماره یک پس ازDirect Swim-up).
۳- لام ها را درون بسکت قرار داده می شود و درون جار حاوی اتانول- اتر(ترکیب مساوی از اتر واتانول ۹۶%) به مدت ۴ دقیقه قرار داده می شود.
۴- بسکت حاوی لام ها از جار خارج کرده و در دمای محیط گذاشته می شود تا خشک شود.
۵-سپس لام ها را در جعبه لام قرار داده و تا زمان رنگ آمیزی در فریزر نگهداری می شود.
۲-۳-۲-۲-۵-۳- روش رنگ آمیزی پاپانیکولا
لام های فیکس شده که در فریزر بودند را بیرون آورده، ۱۹ جار برداشته ودرون آن محلول مورد نظر را ریخته ولام ها را درون بسکت قرار داده و در زمان های مشخص شده طبق دستور العملWHO در جار ها قرار داده می شود.
جدول۲-۲- محلول های لازم برای رنگ آمیزی پاپانیکولا