۴۸

۱۰^۷× ۶/۱

۱۰^۵× ۹/۱

۷۲

۱۰^۵× ۳/۹

۱۰^۴× ۳/۷

روز هشتم

شکل ۴-۳- بررسی جمعیت باکتری در زمان های نمونه برداری پس از مایه زنی در دو فاز مختلف رویشی و زایشی
۴-۳- استخراج Total RNA از بافت گیاه
استخراج Total RNA با بهره گرفتن از کیت دنازیست انجام شد. همچنین با بهره گرفتن از دستگاه نانودراپ، غلظت RNA استخراج شده محاسبه و برای اطمینان از کیفیت، آن در ژل آگارز ۱ درصد الکتروفورز شد.

۴-۳-۱- تعیین کیفیت Total RNA
هر دو باند SrRNA18 و SrRNA 28 به صورت واضح روی ژل آگارز تشخیص داده شد که نشان از کیفیت خوب استخراج داشته است (شکل ۴-۴).

شکل ۴-۴- الکتروفورز Total RNA استخراج شده از بافت ها و باندهای SrRNA18 (پایین) و SrRNA 28 (بالا)
۴-۳-۲- تعیین غلظت Total RNA با بهره گرفتن از نانودراپ
با بهره گرفتن از دستگاه نانودراپ، غلظت Total RNA استخراج شده بر حسب  و میزان خلوص آن با بهره گرفتن از نسبت جذب نور  محاسبه شد (شکل ۴-۵).
شکل ۴-۵- طیف جذب نوری Total RNA استخراج شده با بهره گرفتن از نانودراپ
۴-۳-۳- تیمار DNase
بعداز تیمار DNase به منظور حذف آلودگی ژنومی، به صورت تصادفی از تعدادی نمونه های تیمار شده با DNase، با بهره گرفتن از آغازگر ژن کنترل داخلی ef1-α، PCR گذاشته شد. سپس محصول PCR در ژل آگارز ۱ درصد الکتروفور شد (شکل ۴-۶).

شکل ۴-۶- الکتروفورز محصول PCR بعد از تیمار DNase، از چپ: مارکر، کنترل منفی، نمونه ها، کنترل مثبت
۴-۳-۴- بررسی صحت سنتز cDNA
برای اطمینان از سنتز cDNA تمام نمونه ها، با بهره گرفتن از آغازگر ژن کنترل داخلی ef1-α، تمام نمونه‌ها PCR گذاشته شدند. سپس محصول PCR روی ژل آگارز ۱ درصد برده شد (شکل ۴-۷).

شکل ۴-۷- الکتروفورز محصول PCR پس از سنتز cDNA، از چپ: مارکر، نمونه ها، کنترل مثبت
۴-۵- بررسی بیان ژن ها
با بهره گرفتن از Ct هایی که از دستگاه Real-time RT-PCR برای ژن کنترل داخلی ef1-α و نیز ژن های اصلی مورد بررسی PR1, PDF1.2, LOX2 و VSP2 به دست آمد، میزان بیان نهایی ژن های اصلی محاسبه گردید. همچنین با بهره گرفتن از برنامه Excel نمودار بیان ژن ها رسم و داده ها از لحاظ آماری نیز با نرم افزار SPSS تجزیه و تحلیل گردید.
۴-۵-۱- ژن PR1
برای بررسی بیان ژن PR1 از دستگاه Real-time RT-PCR استفاده شد و نتایج آن در جدول ۴-۲ و شکل ۴-۸ نشان داده شده است.
جدول ۴-۲- مقایسه میانگین بیان ژن PR1

زمان و تیمار

میزان بیان ژن PR1 نسبت به شاهد

صفر- رویشی

۱

۲۴ ساعت- رویشی

۹۷/۱

۴۸ ساعت- رویشی

۳۹/۰