فرایند آپوپتوز را می توان به سه مرحله : القا ، اثرکننده و تجزیه تقسیم کرد. در خلال مرحله القا سلول محرک های گوناگون تحریک کننده مرگ را دریافت می کند. از جمله فقدان عامل بقای ضروری، کم شدن ذخیره متابولیک، اتصال لیگاند به گیرنده و انتقال دهنده پیام مرگ مانند CD95 وگیرنده TNF و یا آسیب توسط سموم، حرارت وتشعشع. از آن جا که رخدادهای بیوشیمیایی مرحله القا، به نوع محرک وابسته هستند، مسیری اختصاصی دارد. تنها در خلال مرحله بعدی که این حوادث آغاز کننده به الگوی منظمی از واکنش های متابولیک ترجمه می شوند و در چنین شرایطی است که تصمیم مرگ گرفته می شود. بنابراین، سرنوشت نهایی سلول در خلال مرحله اثر کننده تابع رخدادی تنظیمی است. در خلال مرحله تجزیه، آنتروپی کلی افزایش می یابد، آنزیم های کاتابولیک فعال شده و از اثرات تنظیمی بیشتر جلوگیری می شود و خرد شدن DNA، تجزیه وسیع پروتئین و مانند آن ظاهر می شود. مرحله اثر کننده را می توان مهمترین مرحله آپوپتوز دانست. زیرا در اثر بر هم کنش بین پروتئین های متفاوت مثل فعال شدن ژن های کشنده و اختلال در چرخه سلولی و تقسیم میتوز، سرنوشت سلول تعیین می شود(Kroemer, et al., 1995).
آپوپتوز بر خلاف نکروز دارای روند متوالی ومشخص می باشد. اصلی ترین ویژگی قابل قبول برای شناسایی آپوپتوز، تغییرات ریخت شناسی سلول است. از جمله تغییرات ریخت شناسی اولیه در یک سلول در حال آپوپتوز، متراکم شدن کروماتین و تغییر شکل آن به صورت اجسام هلالی شکل متراکمی است که در مجاور غشای هسته قرار می گیرد. حجم سلول کاهش یافته و چگالی آن افزایش می یابد. سیتوپلاسم متراکم شده و غشا هسته و سلول به شدت دندانه دندانه می گردد. سپس هسته قطعه قطعه شده تمامی سلول حالت وزیکولر به خود گرفته و به صورت قطعاتی در می آید که توسط غشا پوشیده شده است و اجسام آپوپتوتیک[۴۷] نامیده می شوند. اندمک ها فشرده می شوند و تغییر در اندازه و فعالیت سلول آشکار می گردد.
در غشای سلول برآمدگی حباب مانندی ایجاد می گردد. غشای پلاسمایی پاره نمی شود بلکه به صورت چند گرانول کوچک در می آید که حاوی سیتوپلاسم متراکم و اندامک های دست نخورده آن می باشد که به آن اجسام آپوپتوتیک می گویند. اغلب اجسام آپوپتوتیک در شرایط in vivo بلافاصله توسط سلول های مجاور و ماکروفاژ ها بلعیده شده و توسط لیزوزم تجزیه می گردند. بنابراین پاسخ التهابی دیده نشده یا خیلی کم مشاهده می شود. در این فرایند سلول چروکیده شده وتغییرات هسته ای رخ می دهد. آنزیم های خاصی در سلول فعال شده شروع به تجزیه پروتئین و DNA می کنند. و نیز افزایش غلظت درون سلولی کلسیم که ناشی از خالی شدن منابع سلولی آن مانند شبکه آندوپلاسمی، دیده می شود. دهیدراتاسیون سلول، قرار گرفتن فسفاتیدیل سرین[۴۸] در سطح غشا سلول، افزایش نفوذپذیری میتوکندری، آزاد شدن محتویات میتوکندری به درون سیتوپلاسم، از دست دادن پتانسیل غشا میتوکندری، پروتئولیز لامین B، دناتوره شدن[۴۹] DNA و مشاهده DNA در سیتوپلاسم از دیگر علائم این پدیده می باشد. آپوپتوز معمولاََ در سلول های بالغ منفرد رخ می دهد(Hale, et al., 2004; Walker, 1998).
آپوپتوز مرگ فیزیولوژیک سلولی است که در شرایط طبیعی سبب حذف سلول های پیر، آسیب دیده، اضافی و مضر می شود و برای تکامل و هموستاز بافتی ضروری است(Israels & Israels, 2000). هر گونه اختلال در این روند، منجر به بیماری می شود(Ghavami, et al., 2005)که می تواند ناشی از کاهش مرگ سلولی بوده و موجب ایجاد و رشد سلول های سرطانی و یا اختلال خود گردد. افزایش غیر طبیعی مرگ سلولی در بیماری هایی مثل اختلالات نرودژنراتیو و ایدز دیده می شود(Hashemi & Kroczak, 2005).
۱-۶-۲-۲ مسیر های آپوپتوز
مولکول های متعدد در فرایند آپوپتوز درگیر هستند. تحریک مولکول های پرو آپوپتوزی و یا مهار فاکتورهای آنتی آپوپتوزی بستگی به نوع سلول و محرک دارد. دو مسیر اصلی آپوپتوز، مسیر خارجی یا مسیر وابسته به گیرنده های مرگ[۵۰] و مسیر داخلی یا مسیر میتوکندریایی می باشد(Hashemi & Kroczak, 2005; Yavin & Arav, 2007).
۱-۶-۲-۳- عناصر کلیدی مسیرهای آپوپتوز
گیرندهای مرگ: آپوپتوز از طریق تحریک چندین گیرنده سطح سلولی به وسیله فعالیت کاسپاز ها[۵۱] شروع می شود.
تغییرات غشایی: در مراحل اولیه آپوپتوز در سطح سلول و غشا پلاسمایی تغییرات مهمی رخ می دهد. از جمله این تغییرات حرکت فسفاتیدیل سرین از سطح داخلی غشا سلول به سطح خارجی آن است. این تغییر جزء وقایع زود هنگام آپوپتوز است و از سایر تغییرات مورفولوژیکی نظیر تجمع هسته و چروکیدگی سلول مقدم تر است. اما تمامیت غشا تا مراحل بعدی آپوپتوز دست نخورده می ماند.
آبشارهای پروتئازی: سیگنال های تحریک کننده ی آپوپتوز منجر به فعالیت خانواده ای از پروتئازهای سیستئین داخل سلولی می شوند. کاسپازها نقش محوری در شروع آپوپتوز بازی می کنند. اعضای مختلفی از کاسپازها در سلول های پستانداران شناخته شده اند. از مهمترین آن ها کاسپاز I یا ICE[52] می باشد که به عنوان یک پروتئاز سیستئینی مسئول عمل اینتر لوکین یک بتا می باشد. فعال شدن کاسپازها در نتیجه انتشار سیتوکرم C از میتوکندری به سیتوزول رخ می دهد.
تغییرات میتوکندریایی: فعالیت فیزیولوژیک میتوکندری ها از سلول هایی که تحت آپوپتوز یا نکروز قرار گرفته اند متوقف می شود. در طول آپوپتوز، نفوذپذیری میتوکندری تغییر می کند و فعال کننده های پروتئازی مخصوص آپوپتوز از آن ها منتشر می شوند. در مقدار میتوکندری های آپپتوتیک کاهش زیادی دیده شده است. منقطع شدن غشای خارجی میتوکندری، در نتیجه انتشار سیتوکروم C به سیتوزل و به دنبال آن دپلاریزه شدن غشای خاجی از وقایع قابل توجه در سلولی است که تحت آپوپتوز قرار گرفته. انتشار سیتو کروم C (Apaf-2) موجب فعال شدن کاسپاز ها می شود. ماده دیگری که از میتوکندری در جریان آپوپتوز به درون سیتوزول صادر می شود AIF[53] می باشد(Bowen, 1993). این ماده خاصیت تجزیه پروتئین را دارد وبرای تحریک آپوپتوز کافی است. مشاهده شده که DNA میتوکندری در مراحل ابتدایی آپوپتوز دست نخورده باقی می ماند واین می تواند در بررسی آپوپتوز و مقدار پیشرفت آن کمک کننده باشد.
قطعه قطعه شدن DNA: علامت بیولوژیک خاص آپوپتوز قطعه قطعه شدن DNA است، یک اتفاق تغییر ناپذیر که هنگام مرگ سلولی، قبل از تغییرات غشایی رخ می دهد.
قطعه قطعه شدن DNA با واسطه فعالیت اندونوکلئازهای درون سلولی وابسته به کلسیم ومنیزیم اتفاق می افتد. این آنزیم ها، DNA را در مناطقی که بین نوکلئوزوم ها قرار گرفته است می شکافند وقطعات یکسان DNA ایجاد می کنند. تراکم کروماتین: یکی از تغییرات زود هنگام در آپوپتوز متراکم شدن کروماتین در زیر غشای داخلی هسته می باشد. این فرایند می تواند با یک فلورو کروم پلی نوکلوئید خاص مانند “پرو پیدیوم یدید[۵۴] و یا [۵۵]DAPI” آشکار شود(Bowen, 1993).
قطعه قطعه شدن هسته: اتفاق دیگر آپوپتوز، متراکم شدن هسته است. این همان قطعه قطعه شدن هسته در مراحل کلیواژ، مورولا و یا بلاستوسیست است که کوچکتر از هسته های سالمند(Bowen, 1993).
قطعه قطعه شدن سیتوپلاسم: درصد بسیاری از جنینهایی که به صورت in vitro رشد می کنند، درجات مختلفی از قطعه قطعه شدن سیتوپلاسم در آن ها دیده می شود. این قطعات شبیه به اجسام آپوپتوتیک می باشند که در آن ها اندامک های سلولی مشاهده شده است. ظهور این قطعات همراه با افزایش اختلال کروموزومی بوده و پیش زمینه ای برای شروع آپوپتوز می باشد(Erenpreiss, et al., 2004).
۱-۶-۲-۴- روش های بررسی آپوپتوز
جهت سنجش آپوپتوز و بررسی مکانیسم آن روش های متعددی بر مبنای تغییرات مورفولوژیک و بیو شیمیایی سلول های آپوپتوزی طراحی ومعرفی شده اند. مهمترین نکته ای که می بایست در نظر گرفته شود انتخاب درست تکنیک سنجش آپوپتوز بر مبنای نوع مطالعه (روی سلول یا بافت)، القاءکننده مورد نظر، مکانیسم مورد بررسی و سازگاری حساسیت و اختصاصی بودن نتایج بر مبنای تعداد سلول یا غلظت آنالیت مورد سنجش است. پدیده های بیو شیمیایی که در همه و یا اغلب سلول های آپوپتوزی رخ می دهد به تشخیص بهتر و واضح تر این پدیده در سلول ها کمک می کند. روش انتخابی جهت بررسی آپوپتوز به نوع سلول مورد نظر و هدف تحقیق بستگی دارد. برخی از این روش ها جهت نمونه کوچک مناسب بوده در حالی که برخی دیگر جهت آزمایشات گسترده با نمونه بزرگ به کار می رود(Bröker, Kruyt, & Giaccone, 2005).
۱-۶-۲-۴-۱- بررسی تغییرات غشاء پلاسمایی در مرگ سول
فسفاتیدیل سرین، فسفو لیپدی است که به طور نرمال در سطح داخلی غشاء پلاسمایی قرار گرفته است. یکی از اولین وقایع در طی آپوپتوز خروج فسفاتیدیل سرین وقرار گرفتن آن در سطح سلول است.
این مسئله از دوجهت مهم می باشد: اول اینکه این تغییر معمولا مقدم بر سایر تغییرات مورفولوژی مانند تراکم کروماتین، قطعه قطعه شدن DNA و بر آمدگی غشاء و تشکیل اجسام آپوپتوزی می باشد. دوم اینکه فسفاتیدیل سرین یکی از مولکول های سطح سلول آپوپتوزی است که توسط ماکروفاژها شناسایی می شود و بنابراین نقش کلیدی در حذف سلول های مرده قبل از پاره شدن غشاء ان ها و بروز واکنش التهابی و تخریب بافتی دارد. دومین تغییر غشایی از دست دادن یکنواختی غشاء می باشد که در نکروز در مراحل اول مشاهده می شود در حالی که در آپوپتوز از جمله وقایع ثانویه می باشد(Heemels, Dhand, & Allen, 2000).
۱-۶-۲-۴-۱-۱- تعیین فسفاتیدیل سرین سطح بیرونی غشاء سلول
با بهره گرفتن از یک پروتئین متصل شونده به فسفاتیدیل سرین این کار صورت می گیرد، که همان
آنکسین V[56] است. در این حالت آنکسین V فقط به فسفاتیدیل سرین موجود در لایه خارجی غشاء متصل می گردد. این روش سریع وساده بوده و سلول ها می توانند فیکس شوند(Hashemi, Karami-Tehrani, & Farzami, 2003).
۱-۶-۲-۴-۲- بررسی سیتوتوکسیسیتی
بررسی سیتوتوکسیسیتی اولین گام در بررسی آپوپتوز است. با این روش میزان مرگ سلولی مورد ارزیابی قرار می گیرد. این روش قادر به تمایز آپوپتوز از نکروز نیست. با بررسی سیتوتوکسیستیی درصد سلول های زنده یا مرده نسبت به گروه شاهد به دست می آید. دو روش متداول بررسی سیتوتوکسیستی، روش [۵۷]MTT و رنگ آمیزی تریپان بلو است.
۱-۶-۲-۴-۳- بررسی تغییرات مورفولوژی
تغییرات مورفولوژی در آپوپتوز عبارتنداز : چروک شدن سلول، تراکم کروماتین، قطعه شدن هسته و تشکیل اجسام آپپتوتیک(Sun, Jurisicova, & Casper, 1997). در طی این تغییرات، میتوکندری بخوبی حفظ شده در حالی که در هسته تراکم کروماتین و قطعه قطعه شدن DNA رخ می دهد. سلول ها چروکیده شده، از سلول های مجاور جدا شده و غشاء سلول برآمده می شود و به صورت اجسام آپوپتوزی جدا شده و غشاء سلول برآمده می شود و به صورت اجسام آپوپتوزی جدا می شود که از لحاظ اندازه و ساختمان با یکدیگر متفاوتند.
۱-۶-۲-۴-۳-۱- استفاده از میکروسکوپ الکترونی
در بررسی مورفولوژی هسته ی سلول های آپوپتوزی توسط میکروسکوپ الکترونی، هسته ی قطعه قطعه شده و کروماتین متراکم در کنار آن دیده می شود. سیتوپلاسم متراکم دارای برآمدگی حباب مانند شده و حباب های متفاوتی با اندازه و محتویات متفاوت تشکیل می شوند که برخی از آن ها حاوی قطعه های هسته نیز می باشند. علی رغم تغییرات هسته ای، ارگانل های سیتوپلاسمی در طی مرگ آپوپتوزی به خوبی حفظ شده در حالی که در نکروز هیچ تغییری در کروماتین و هسته مشاهده نشده بلکه سلول متورم شده و غشاء پلاسمایی از هم گسیخته و محتویات سلولی به بیرون می ریزد. این روش وقت گیر و پر هزینه می باشد.
۱-۶-۲-۴-۳-۲- استفاده از میکروسکوپ نوری وفلورسانس
با میکروسکوپ نوری می توان تراکم کروماتین و اجسام آپپتوتیک در سلول های رنگ آمیزی شده با هماتوکسیلین ائوزین(H&E) را مشاهده کرد. میکروسکوپ نوری توانایی کمی برای شناسایی سلول های آپپتوتیک دارد، ولی اگر هسته با پروپیدیوم یدید رنگ آمیزی شود می توان آپوپتوز را از نکروز تمایز داد. میکروسکوپ فلورسانس دقت بیشتری دارد. از رنگ های هسته ای فلورسانس از قبیل هوخست-۳۳۲۵۸ و [۵۸]DAPI می توان برای تغییرات هسته ای استغاده کرد. این رنگ ها به دلیل خاصیت فلورسانس، در مطالعات میکروسکوپ فلورسنت جهت تشخیص مورفولوژی هسته سلول های آپوپتوزی استفاده می شود. اساس این روش تغییرات اولیه هسته و مشاهده اجسام آپوپتوزی می باشد. باید توجه داشت قبل از رنگ آمیزی، سلول های به هم چسبیده از سلول های مجاورشان جدا شوند(Huerta, Goulet, Huerta-Yepez, & Livingston, 2007).
۱-۷- منشاء آسیب DNA اسپرم
دلایل ایجاد آسیب در DNA اسپرم مانند دلایل ایجاد ناباروری در مردان پیچیده و وابسته به فاکتورهایی از جمله عوامل درون بیضه ای یا خارج از بیضه ای است . اگرچه آسیب DNA اسپرم درمردان نابارور شناسایی و به نقص در مرحله اسپرماتوژنز مربوط است، ولی اسپرم افراد بارور نیز با میز ان قابل تشخیصی از آسیب DNA همراه است(Ozmen, Koutlaki, Youssry, Diedrich, & Al-Hasani, 2007).
اسپرماتوژنز شامل تکثیر سلول های جنسی مذکر (germ cell)، تقسیم میوز و تمایز اسپرماتید به اسپرماتوزوا است. بنابراین آسیب DNA اسپرم یا ساختار کروماتین آن می تواند در هر مرحله از اسپرماتوژنز رخ دهد. آسیب DNA در اسپرماتوزوای بالغ می تواند به علت نقایصی در بسته بندی کروماتین باشد که از شکستگی های آندوژنی در DNA ناشی می شود یا ناشی از روند آپوپتوز قبل از انزال اسپر م ها باشد . به علاوه میزان بالای تولید ROS نیز می تواند منجر به آسیب DNA شود(Aitken & Krausz, 2001; Moustafa, et al., 2004; Zini & Libman, 2006). افزون بر این، فاکتورهای محیطی مانند سن، مصرف دارو و سیگار، فاکتورهای هورمونی وافزایش دمای بیضه ها و بیماری هایی مانند واریکوسل نیز از دیگر دلایل ایجاد آسیب در DNA اسپرم به شمار می روند(Gaur, Talekar, & Pathak, 2007; Ozmen, et al., 2007; Schmid, et al., 2007; Ståhl, et al., 2006).
۱-۷-۱- بسته بندی غیرطبیعی کروماتین
ساختار کروماتین اسپرم برخلاف سلول های سوماتیک که ساختار هیستونی دارد از پروتئین های بیضه ای تشکیل شده است. در پستانداران ۳ نوع از این پروتئین ها وجود دارد، پروتامین ۱ که عمده ترین پروتئین اتصالی به DNA است، پروتامین ۲ که فقط در برخی از گونه ها بیان می شود و پروتئین های انتقالی که هنگام جابه جایی هیستون با پروتامین به عنوان پروتئین های واسطه عمل می کنند . طی مرحله اسپرمیوژنز، در حدود ۸۵ درصد این هیستون های بیضه ای توسط پروتامین ها جایگزین می شود و علت باقی ماندن ۱۵ درصد هیستون ها، احتمالا به دلیل نقش ژن های موجود در این قسمت ها در لقاح، رشد اولیه جنینی و بیان یک سری از ژن ها از جمله ژن های اثرگذار (Imprinting) است(V.W. Aoki & D.T. Carrell, 2003; Carrell, Emery, & Hammoud, 2007; Tarozzi, Bizzaro, Flamigni, & Borini, 2007). همراه با جابجایی هیستون ها، پروتامین های غنی از آرژنین و سیستئین طی عبور از اپیدیدیم، گروه های سولفیدریل آزاد سریعاً اکسید شده و باعث تشکیل پیوندهای S-S دی سولفیدی می شود. وجود این پیوندها دلیل پایداری ساختار کروماتین است . همچنین وجود مولکول های Zn باعث به وجود آمدن پیوندهای غیرکووالان s….Zn….s می شود که این پیوندها نیز در افزایش پایداری ساختار کروماتین مؤثر هستند. پس از لقاح دوباره هیستون های موجود در ژنوم تخمک جایگزین پروتامین ها شده و فرایند متراکم شدن کروماتین خاتمه می یابد . در حقیقت نقص در محتوای میزان پروتامین در مردان نابارور بیانگر عدم متراکم شدن صحیح کروماتین برای روند لقاح طبیعی، مستعد شدن به آسیب DNA، تراکم زودرس کروماتین (PCC) بعد از انجام ICSI بوده و با عدم فعال شدن تخمک همراه است.
مطالعات مختلف نشان داده اندکه در مردان نابارور نسبت هیستون/ پروتامین نسبت به افراد بارور بیشتر است . وجود نقص در نسبت هیستون / پروتامین باعث نقص در تراکم کروماتین اسپرم شده که همین امر مستعد شدن DNAی اسپرم برای آسیب در مقابل شوک های خارجی را به دنبال دارد. نتایج اخیر بیانگر یک ارتباط مستقیم بین کمبود پروتامین و آسیب DNA و در نتیجه کاهش میزان لقا ح در این بیماران است(Zini & Libman, 2006).
۱-۸- ساختار کروماتین اسپرم و تأثیر آن بر ناباروری
۱-۸-۱- بررسی ساختار کروماتین اسپرم
سلامت کروماتین هسته اسپرم علاوه بر ساختارهای نوکلئوزومی و عملکرد هیستونها که در هسته سلولهای سوماتیک اتفاق میافتد، وابسته به پروتئین هستهای دیگری به نام پروتامین است. پروتامین یکی از پروتئینهای مهم در سلولهای جنسی مذکر است و نقش مهمی در باروری مردان ایفا می کند. پروتامین یکی از پروتئینهای هستهای بوده و که به DNA متصل است. این پروتئین در روند اسپرمیوژنز با اتصال به DNA هسته اسپرم از طریق جایگزینی با پروتئینهای هیستونی باعث متراکم شدن مضاعف ژنوم هسته اسپرم می شود. این پدیده نقش بسیار مهمی در توانایی اسپرم در فرایند لقاح و باروری تخمک ایفا می کند. تحقیقات زمینهای بیانگر این است که هر گونه تغییری در بیان طبیعی یا عملکرد این پروتئین احتمالاً منجر به ناباروری و عقیم شدن مردان می شود. با توجه به اینکه هر ساختار پروتئینی از بیان یک ژن حاصل می شود، مقدار صحیح بیان یک پروتئین و عملکرد طبیعی آن وابسته به یک ساختار ژنی سالم و نیز تنظیماتی است که پس از رونویسی، طی ترجمه و پس از ترجمه صورت میگیرد. از این رو در کنار تمام تحقیقاتی که در رابطه با پروتامین صورت میگیرد، بررسی نقصهای احتمالی در ساختار ژنی و نیز سطوح رونویسی و ترجمه از ژن، لازم و ضروری است.
۱-۹- نقش آپوپتوز در آسیب DNA اسپرم
طی روند اسپرماتوژنز در پستانداران، مرگ سلول های زاینده رخ می دهد و به نظر می رسد که این مرگ برنامه ریزی شده باعث حذف ۲۵ در صد از اسپرم ها می شود . مرگ انتخابی سلول ها به صورت طبیعی نقش مهمی را در روند اسپرماتوژنز ایفاء می کند(Angelopoulou & Karayiannis, 2000; Blanco‐Rodríguez & Martínez‐García, 1996).
مرگ سلول ها به طور عمده توسط مکانیزم آپوپتوز که یک پدیده فیزیولوژیک همراه با یکسری وقایع آبشاری است، رخ می دهد. مطالعات متعدد روی موش نشان می دهد که فاکتورهای پرو و آنتی آپوپتوز نقش مهمی را طی روند اسپرماتوژنز و ایجاد هموستاز در سلول های زاینده ایفاء می کند. به علاوه سلو لهای سرتولی از طریق سیستم [۵۹]FAS می توانند آپوپتوز را شروع و میزان آن را تنظیم کنند . این سیستم فعالیت خود را از طریق واکنش بین پروتئین FAS با لیگاند خود (FAS) انجام می دهد. همچنین فعالیت های آبشاری در روند آپوپتوز شامل فعال شدن اندونوکلئازها که شکست در رشته های DNA را القاء می کند نیز هست . تخریب DNA به قطعات Kb185 یکی از نشانه های مشخصه آپوپتوز و مرگ سلولی است که از همین خاصیت برای شناسایی سلول های آپوپتوز شده، استفاده می کنند(Ozmen, et al., 2007).
روند آپوپتوز دو نقش عمده را طی اسپرماتوژنز طبیعی ایفاء می کند که عبارتند از کاهش سلول های زاینده به آن تعدادی که توسط سلول های سرتولی حمایت شود و همچنین حذف انتخابی اسپرم های غیرطبیعی . طی این روند بسیاری از سلولهای ناکارآمد از جمله سلولهای مسن، نابالغ یا آسیب دیده حذف می شوند. پیامد آپوپتوز رخ دادن یک سری از وقایع از جمله اختلالات غشای سلول، نا منظم شدن اسکلت سلولی، متراکم شدن هسته و قطعه قطعه شدن ساختار DNA است(Huszar, Sbracia, Vigue, Miller, & Shur, 1997; Sakkas, et al., 1999; Tarozzi, et al., 2007). به علاوه یک سری پروتئینازهای ویژه به نام کاسپاز نیز نقش مهمی را در تنظیم میزان آپوپتوز ایفاء می کنند. این پروتئینازها ابتدا به صورت پروآنزیم در اپیتلیوم لوله های منی ساز ترشح شده و سپس باعث شروع فعالیت های آبشاری دیگری می شوند که سیگنال های پروآپوپتوز را القاء می کند. گیرنده های مرگ سلولی در سطح اسپرم مانند FAS و گیرنده TNFα از جمله فاکتورهایی هستند که توسط آنزیم کاسپاز فعال شده و منجر به مرگ سلولی می شود(Ozmen, et al., 2007; Tarozzi, et al., 2007).
احتمالاً مکانیسم های مختلفی در رابطه با اسپرماتوزوای غیرطبیعی در مایع منی وجود دارد که از آن جمله می توان به نظریه Abortive apoptosis یا فرار از آپوپتوز اشاره کرد به این صورت که وجود مارکرهای آپوپتوز در مایع منی نشان دهنده تولید اسپرم غیرطبیعی است که از فرایند آپوپتوز فرار کرده و منجر به بیان نشانگرهای آپوپتوز شده است(Aitken, Baker, & Sawyer, 2003; Sakkas, et al., 2002).
۱-۱۰- استرس اکسیداتیو به واسطه ROS
اسپرم به دلیل وجود اسیدهای چرب غیراشباع فراوان در سطح غشای پلاسمایی و همچنین به دلیل کمبود آنزیم های محافظتی در سیتوپلاسم در برابر شوک های اکسیداتیو بسیار آسیب پذیر است . طی دهه گذشته مطالعات نشان داده است که شوک اکسیداتیو باعث ایجاد آسیب غشای پلاسمایی اسپرم شده و احتمالاً بر فعالیت اسپرم تاثیر می گذارد و منجر به ناباروری مردان می شود. منشاء تولید ROS در مایع منی ابتدا خود اسپرماتوزوآ و سپس لوکوسیت های چند هسته ای است(Aitken & Baker, 2004, 2006; Aitken & De Iuliis, 2007; Hammadeh, et al., 2006; Lopes, Jurisicova, Sun, & Casper, 1998).
به علاوه مطالعات نشان می دهد که ارتباط معنی داری بین تولید ROS و آپوپتوز وجود دارد که در نهایت منجر به آسیب DNA در اسپرم می شود(Irvine, et al., 2000; Lopes, et al., 1998).
همچنین مشخص شده، درافرادی که میزان زواید سیتوپلاسمی در مایع منی زیاد است، مرحله اسپرماتوژنز غیرطبیعی بوده و با افزایش میزان تولید ROS همراه هستند(Aitken, et al., 1998; Huszar, et al., 1997).
۱-۱۱- تاثیر عوامل محیطی برسلامت DNA و میزان موفقیت روش های کمک باروری
عوامل محیطی که شامل عوامل اجتماعی و شیمیایی است. به طور خلاصه میتوان عوامل اجتماعی را به زیرگروه هایی چون رفتارهای اجتماعی( استعمال الکل، کافئین، سیگار و سایر مواد مخدر) عوامل شیمیایی ( مواجهات شغلی، مواجهه با سرب یا سایر فلزات سنگین، مواجهه مستمر با گرما، دارو، شیمی درمانی و رادیو تراپی، آلودگی های اتمسفر) سن، ژنتیک و سن ازدواج افراد تقسم بندی کرد(Paul, Melton, & Saunders, 2008).
۱-۱۱-۱- مصرف سیگار
بین مصرف سیگار و کاهش کیفیت مایع منی ارتباط وجود دارد مواد مضری چون آلکالوئید، نیتروزآمین، نیکوتین و هیدروکسی کوتینین در سیگار وجود دارد که باعث تولید رادیکال های آزاد در بدن می شود(Künzle, et al., 2003). در ضمن با بهره گرفتن از تست های [۶۰]SCSAو TUNEL [۶۱] مشخص شده است که آسیب DNA اسپرم در افراد سیگاری بسیار بیشتر از افراد غیر سیگاری است. برای افزایش فراگمنتاسیون DNA دو علت ذکر شده است:
۱) انتشار لکوسیت ها متعاقب استرس اکسیداتیو ناشی از متابولیت های دود سیگار که سبب واکنش التهابی از طریق آزادسازی واسطه های شیمیایی مانند اینترلوکین۶ و ۸ در مجاری ژنیتال شده و خود باعث فعال شدن مجدد لکوسیت ها و افزایش رادیکال های فعال اکسیژن ROS می شود.
۲) میزان کمتر آنتی اکسیدا نت ها در مایع منی افراد سیگاری نسبت به غیر سیگاری ها(Potts, Newbury, Smith, Notarianni, & Jefferies, 1999).
همچنین تحقیقات نشان داده است که مواد سرطان زای موجود در دود سیگار بر روند لانه گزینی متعاقب پروسه ی IVF و ICSIو همچنین موفقیت این دو روش در زوج های سیگاری ، تاثیر گذار است(Künzle, et al., 2003) به علاوه پسرانی که مادرشان در دوره ی بارداری سیگار کشیده اند در زمان بلوغ با کاهش پارامترهای اسپرمی مواجه اند(Storgaard, et al., 2003).در معرض دود سیگار قرار گرفتن حیوانات و انسان ها و همچنین در معرض قرارگیری با متابولیت های نیکوتین در محیط بدن، سبب کاهش در صد اسپرم های متحرک زنده و کاهش توانایی نفوذ اسپرم به درون تخمک می شود(Kapawa, et al., 2004). غلظت کوتینین نیز در مایع منی با مورفولوژی غیر طبیعی اسپرم مرتبط است. گفتنی است مصرف توام سیگار و الکل و تاثیر آن بر پارامترهای اسپرم به میزان چشمگیری بالاتر بوده بنابراین هر یک از والدین حین درمان توسط روش های کمک باروری باید در زمینه عدم استعمال سیگار مشاوره شوند(Martini, et al., 2004).
