فسفر:
فسفر در فسفریلاسیون نوری، مسیر پنتوز فسفات و گلیکولیز و یا به عبارت دیگر در چرخههای متابولیکی که به ATP و NADPH مربوط می شود، نقش مهمی دارد. فسفر عضو مهم غشاهای بیولوژیکی (در فسفولیپیدها) و اسیدهای نکلوئیک است. در گیاهانی که دارای کمبود فسفر هستند. تحرک نشاسته به رگبرگهای آنها خسارت وارد می کند. در چنین گیاهانی نشاسته به مقدار زیاد در کلروپلاستها تجمع مییابد. وجود فسفر در محیط کشتی که دارای سطح بالای فسفات معدنی است، مانع سنتز بیولوژیکی اتیلن[۹۲] میگردد. در محیط کشت دارای آگار، میزان فسفر قابل دسترس به دلیل جذب توسط آگار کاهش مییابد (ادوین، ۲۰۰۸).
۱-۶-۱-۳- عامل ژلی:
آگار[۹۳] گرانترین ترکیب در محیط کشت جامد میباشد. آگار قابل حل به صورت ژل در می آید که قادر به جذب آب میباشد. نوع آگار مورد استفاده می تواند بر روی آزمایشهای کشت بافت تاثیر بگذارد. متخصصین کشت بافت گیاهی اغلب از آگار دیفکو-باکتو با غلظت ۶/۰ تا ۸/۰ درصد استفاده می کنند اگر چه سایر انواع آگار (گیبکوفیت آگار، فلوآگار و غیره) نیز مورد استفاده قرار میگیرند (ادوین، ۲۰۰۸).
۱-۶-۱-۴- ویتامینها:
ویتامینها دارای وظایف کاتالیزوری در واکنشهای آنزیمی میباشند. ویتامینها دارای اهمیت زیادی در کشت سلولی میباشند. از جمله ویتامینهای مورد استفاده در کشت بافت میتوان از تیامین (B1)، کلسیم پانتوتنات یا اسید پانتوتنیک، اسید فولیک (ویتامین M)، ریبوفلاوین (لاکتوفلاوین، ویتامین B2)، اسید اسکوربیک (ویتامین C)، اسید نیکوتنیک (ویتامین PP، نیاسین)، پیرودوکسین (آدرمین، ویتامین B6)، بیوتین (ویتامین H)، پاراآمینواسید بنزوئیک، توکوفرول (ویتامین E) و اینوزیتول (میواینوزیتول، مزواینوزیتول) نام برد (ادوین، ۲۰۰۸).
۱-۶-۱-۵- تنظیم کننده های رشد گیاهی:
نوع و غلظت تنظیم کننده های رشد گیاهی مورد استفاده در کشتبافت بر حسب کشت سلولی تغییر می کند. مواد تنظیم کننده رشد گیاهی را میتوان به پنج گروه اکسینها، جیبرلینها، سیتوکینینها، بازدارندههای رشد و اتیلن تقسیم بندی نمود (کریکوریان، ۱۹۹۵).
اکسینها:
اکسینها طیف وسیعی از عکسالعملهای رشد را باعث میشوند. اکسینها معمولا باعث رشد طولی ساقه، تورم بافتها، تقسیم سلولی (تشکیل کالوس) و تشکیل ریشه های نابجا و ممانعت از تشکیل شاخه های نابجا و جانبی میشوند و غالبا رویانزایی را تحریک می کنند. در غلظت کم اکسین، تشکیل ریشه های نابجا، حالت غالب دارد در حالی که در غلظت زیاد اکسین تشکیل ریشه صورت نمیگیرد و تشکیل کالوس اتفاق میافتد (بلارمینو و همکاران، ۱۹۹۴).
سیتوکینینها:
این گروه شامل سیتوکینینهای طبیعی ۲- ایزوپنتنیل آدنین[۹۴] (۲ip) و زآتین و سیتوکینین مصنوعی کینتین و بنزیل آمینو پورین[۹۵] (BAP) هستند. سیتوکینینهای مصنوعی، فعالیت بیولوژیکی بسیار بالا دارند و گران نیستند، لذا کاربرد وسیعی در کشت بافت دارند. سیتوکینینها باعث تورم بافتها، تحریک نمو جوانههای جانبی و نابجا و تحریک تقسیم سلولی میشوند. در کشت بافت گیاهی، نقش سیتوکینینها در تحریک نمو جوانه جانبی از طریق کاهش غالبیت انتهایی بسیار با اهمیت است. سیتوکینینها در حضور گرما پایدار هستند و ممکن است که قبل از اتوکلاو کردن به محیط کشت اضافه شوند (معینی و کهریزی، ۱۳۸۲).
جیبرلینها:
در بین انواع جیبرلینها، GA3 بیشتر از همه مورد استفاده قرار میگیرد (اسکاتلند[۹۶] و لنگیل[۹۷]، ۱۹۹۸) جیبرلینها نیز علاوه بر افزایش رشد طولی ساقهها، باعث کاهش میزان غدهزایی در سیبزمینی میشوند (بابر[۹۸] و جین[۹۹]، ۱۹۹۸).
۱-۵-۱- عوامل فیزیکی موثر بر کشت بافت:
عوامل فیزیکی شامل نور (شدت و مدت)، دما، pH، رطوبت، قابلیت دسترسی به آب (اسمولاریته محیط کشت)، میزان اکسیژن قابل دسترسی، میزان گاز کربنیک موجود در فضای کشت و همچنین میدانهای الکتریکی، عوامل جوی و فضایی مثل پرتوها، امواج صوتی و الکترومغناطیس (ادوین وهمکاران، ۲۰۰۸). pH مناسب برای رشد و کشت بافت گیاهی معمولا در محدوده ۵٫۵ تا ۶ میباشد. در pH بالاتر از ۶، ژل سفت و سخت می شود (بلارمینو و همکاران، ۱۹۹۴).
در رابطه با نور باید سه عامل طول روز، شدت نور و ترکیب آن را در نظر گرفت. در رابطه با تاثیر طول روز در کشت درون شیشه ای اطلاعات کمی موجود است. معمولا طول روز بین ۱۴ تا ۱۶ ساعت در نظر گرفته شده ولی نور مدوام هم به کار رفته است. البته در موارد بسیار خاص، رشد در تاریکی مداوم هم اتفاق افتاده است. غالبا در کشت بافت از میزان تشعشع پایین استفاده می شود (اسکاتلند و لانگیل، ۱۹۹۸).
۱-۶-۱- تاثیر مواد گیاهی بر کشت بافت:
ریزنمونه قطعهای از بافت گیاهی است که در محیط کشت قرار میگیرد. انتخاب ریزنمونه مناسب در کشت بافت گیاهی از اهمیت زیادی برخوردار است. عوامل زیادی در انتخاب ریزنمونه مناسب دخالت دارند.
در کشت میزان موفقیت در ریزنمونههایی که از جوانههای انتهایی گرفته شده بیشتر از جوانههای جانبی است (سنِویراتنی[۱۰۰] و همکاران، ۱۹۹۸). به نظر میرسد که قدرت رشد جوانههای انتهایی نسبت به جوانههای جانبی بیشتر بوده و استفاده از ریزنمونههای انتهایی در اغلب کشتها مناسبتر است.
سن ریزنمونه در انتخاب ریزنمونه مناسب اهمیت زیادی دارد. بافتهای جوانتر معمولا در محیط درون شیشه ای زودتر پاسخ می دهند (اسمیت[۱۰۱] و درو[۱۰۲]، ۱۹۹۰).
فصلی که ریزنمونه از گیاه جدا می شود نیز بر روی پاسخ ریزنمونه به کشت بافت موثر است. به عنوان مثال، جوانه ها یا ساقههای گرفته شده از گیاه در فصل بهار که گیاه در حال رشد است، پاسخ خوب و سریعی به کشت بافت نشان می دهند (اسمیت و درو، ۱۹۹۰).
اندازه ریزنمونه نیز تاثیر مهمی در کشت بافت دارد. عموما القا رشد در ریزنمونههای کوچکتر نسبت به ریزنمونههای بزرگتر مشکلتر است. ریزنمونههای گرفته شده از گیاهان سالم نسبت به گیاهانی که تحت تنش مواد غذایی و آبی بوده یا در معرض عوامل بیماریزا میباشند، مفیدتر هستند. همچنین نوع گونه گیاهی تاثیر مهمی در پاسخ به کشت بافت گیاهی دارد. معمولا کشت بافت در گیاهان دولپهای نسبت به گیاهان تک لپهای با موفقیت بیشتری همراه است (موحدی، ۱۳۹۰).
۱-۷-۱- تولید غده[۱۰۳]:
با توجه به اینکه هدف اصلی کاربرد کشت بافت، بهبود تولید سیبزمینی در سطح مزرعه است، بنابراین کلیه روشهای به کار رفته باید توانایی خود را در شرایط مزرعه به اثبات برسانند. بطور مثال، در روشهای مختلف تکثیر نهایتا به گیاهچه میرسیم این گیاهچه بایستی بتواند در شرایط مزرعه رشد کرده و نهایتا تولید غده کند. ولی به دلیل اینکه گیاهچه در شرایط کنترل شده از نظر نوری و حرارتی رشد کرده، توانایی تحمل نوسانات شرایط محیطی را ندارد و در نتیجه اگر بلافاصله گیاه به شرایط مزرعه منتقل شود، سریعا از بین میرود، بنابراین نشاء کردن گیاهچه در شرایط مزرعه بدون این که تدریجا با شرایط محیطی سازگاری پیدا کند، بی نتیجه خواهد بود (وانگ و هو، ۱۹۸۵).
در طی چند سال اخیر توجه زیادی به تولید غده در شرایط درون شیشه شده است و تا کنون تحقیقات وسیعی در ابعاد مختلف، جهت رسیدن به شرایط ایدهآل انجام گرفته است.
مزایای تولید غده در شرایط درون شیشه عبارتند از:
-
- امکان انتقال مستقیم ریزغده از آزمایشگاه به مزرعه (آکیتا و تاکایاما، ۱۹۹۴).
-
- به دلیل اینکه غدهها دارای رکود هستند، ذخیرهسازی و ارسال آنها به سهولت انجام می شود (وانگ و هو، ۱۹۸۵).
-
- تولید غده می تواند به مقدار زیاد و بدون در نظر گرفتن فصل خاصی انجام گیرد (باجاج و ساپوری، ۱۹۸۸).
-
- در صورتی که غدهها از گیاهچههای عاری از بیماری بدست آیند، از نظر قوانین قرنطینه بین المللی، ارسال آنها با مشکل مواجه نخواهد بود (دادس[۱۰۴]، ۱۹۸۸).
-
- برای ارسال مواد گیاهی به سایر نقاط، اگر مرحله ترانزیت به تاخیر بیافتد، در صورتی که ماده ارسالی غده باشد، در کیفیت رشد بعدی آن افتی ایجاد نخواهد شد (دادس، ۱۹۸۸).
-
- جهت حفظ ژرمپلاسم نیاز به کشت مجدد در محیط کشت جدید نیست (هوسی[۱۰۵] و استیسی[۱۰۶]، ۱۹۸۴).
-
- سازگاری بیشتر با انواع ماشینهای کشت مکانیزه دارد (هوسی و استیسی، ۱۹۸۴).
بنابراین، با توجه به مزایای ذکر شده، از این روش میتوان جهت حفظ ژرمپلاسم و انتقال سریع نتایج آزمایشگاهی به مزرعه استفاده نمود.
فصل دوم
مروری بر تحقیقات انجام شده
با توجه به اینکه سیبزمینی دارای تکثیر رویشی میباشد، بنابراین گیاهان حاصل از تکثیر آن از نظر ژنتیکی با گیاه منشاء خود تفاوتی ندارند. به همین دلیل در کاربرد روشهای کشتبافت و تکثیر سیبزمینی بایستی از روشهایی که تنوع ژنتیکی ایجاد نمیکند استفاده کرد. یکی از روشهایی که دارای خصوصیت فوق باشد، روش کشت قلمههای ساقه و رشد جوانههای جانبی در محیط کشت مصنوعی (درون شیشه) است. اکثر محققین جهت تکثیر کلونهای سیبزمینی از این روش استفاده می کنند ولی شرایط و نوع استفاده ممکن است در بررسیهای مختلف متفاوت باشد. در ادامه مطلب به بررسی برخی از آنها و نتایج حاصله اشاره می شود.
لاوارنس[۱۰۷] و بارکر[۱۰۸] (۱۹۶۳) از جوانههای جانبی رویشی که در شرایط تاریکی رشد کرده بود، استفاده کرده و آنها را در محیط کشت وایت همراه با ۵/۲ میلیگرم در لیتر کلسیم پانتوتنات کشت دادند. هدف آنها از این آزمایش مطالعه درجه حرارتهای مطلوب، فتوپریود مناسب و غلظتهای مختلف ساکارز بود. نتیجهای که در این آزمایش حاصل شد به این صورت اعلام گردید که جهت غده زایی، استفاده از ساکارز در غلظت ۸% و روشنایی متوسط یا تاریکی مناسبتر است. همچنین فتوپریودهای ۸، ۱۶ و ۲۴ ساعت روشنایی برای غده زایی مطلوب نیست.
هارمی[۱۰۹] و همکاران در سال (۱۹۶۶) بیان کردند که افزودن تنظیم کننده های رشد تنها در صورتی نمو ریزغدهها را افزایش میدهد که ساکارز کافی (۸%) تامین باشد.
در آزمایشی که روکا[۱۱۰] و همکاران (۱۹۷۸) روی تکثیر ارقام سیبزمینی انجام دادند، تکثیر مواد گیاهی در دو مرحله انجام شد. در مرحله اول از ساقه گیاهان عاری از عوامل بیماریزا، قلمههای تک جوانه برش زده و در محیط کشت پایه MS که با ۳% ساکارز و ۲ میلیگرم در لیتر کلسیم پانتوتنات و هورمونهای NAA و BAP و GA3 تکمیل شده بود، کشت دادند. سپس ظروف کشت شده در دمای ۲۴-۲۲ درجه سانتی گراد و شدت نور ۱۰۰۰ لوکس و فتوپریود ۱۶ ساعته قرار گرفتند.
در مرحله دوم، از گیاهچههای حاصل از مرحله قبل، قطعاتی را برش زده و درون فلاسکهای ۱۲۵ میلیلیتری محتوی ۱۵ میلیلیتر محیط غذایی کشت شدند. جهت رشد جوانههای جانبی کشتها را روی دستگاه شیکر با ۹۰ دور در دقیقه با فتوپریود و درجه حرارت مشابه مرحله قبل ولی شدت نور ۲۰۰۰ لوکس که توسط لامپهای فلورسنت ۴۰ وات ایجاد میشد، قرار دادند. آنها از این آزمایش چنین نتیجه گرفتند که استفاده از روش فوق بیشترین ثبات ژنتیکی را در گیاهان حاصل از تکثیر ایجاد می کند.
وانگ و هو در سال (۱۹۸۲) آزمایشی با هدف تولید انبوه غده سیبزمینی به روش درون شیشه انجام دادند. آنها جهت تکثیر از مواد گیاهی عاری از ویروس حاصل از کشت مریستم استفاده کردند و برای تولید غده، گیاهچههای عاری از ویروس را در یک محیط مایع محتوی محیط پایه MS همراه با BAP و ساکارز کشت نمودند. آنها در این تحقیق، روی مقادیر مناسب BAP و ساکارز مطالعه میکردند و به این نتیجه رسیدند که شرایط مطلوب جهت غده زایی انبوه در شرایط درون شیشه استفاده از محیط کشت مایع MS محتوی ۱۰ میلیگرم در لیتر BAP و ۸% ساکارز است. شرایط مطلوب جهت رشد را نیز دمای ۲۰ درجه سانتی گراد و فتوپریود ۸ ساعته با شدت نور ۱۰۰۰ لوکس تعیین کردند. در این تحقیق در مرحله غده زایی از فلاسکهای ۵۰۰ میلیلیتری محتوی ۲۰۰ میلیلیتر محیط کشت غدهزایی استفاده شد.
سنگر[۱۱۱] و دینگرا[۱۱۲] در سال (۱۹۸۴) جهت تکثیر مواد گیاهی حاصل از کشت مریستم با بهره گرفتن از روش کشت قلمه تک جوانه آزمایشی با هدف بدست آوردن گیاهچههای زیاد با ساقه و ریشه های قوی انجام دادند. در این آزمایش از غلظتهای مختلف NAA در محیط کشت استفاده شد. در پایان چنین نتیجه گیری شد که غلظت ۵/۰ میلیگرم در لیتر NAA بهترین غلظت جهت رشد ساقه و ریشه قوی گیاهچهها است.در این آزمایش گیاهچهها در شرایط نوری ۲۰۰۰ لوکس و فتوپریود ۱۶ ساعته و دمای ۲±۲۵-۲۰ درجه سانتی گراد قرار گرفته بودند.
هوسی و استیسی (۱۹۸۴) با آزمایشی که بر روی فاکتورهای موثر بر غدهزایی سیبزمینی در شرایط درون شیشه انجام دادند چنین نتیجه گرفتند که غدهزایی در محیط کشت دارای ۲ میلیگرم در لیتر BAP و ۶% ساکارز و در فتوپریود ۸ و ۲۴ ساعته انجام میگیرد. اما اثر تحریک کنندگی BAP در شرایط روز کوتاه بیشتر از روز بلند میباشد. هم چنین افزودن کلروکلین کلراید[۱۱۳] (CCC) به تنهایی باعث کاهش غدهزایی نسبت به حالتی که همراه با BAP در محیط کشت باشد میگردد. ABA دارای اثر کم و GA3 دارای اثر بازدارندگی بر روی غدهزایی است و نیز با بستن درب ظروف کشت، غده زایی محدود می شود ولی اگر از مواد جذب کننده اتیلن مثل زغال فعال[۱۱۴] استفاده شود تاثیری نخواهد داشت.
این محققین همچنین محیط مناسب برای ریزغدهزایی را محیط MS دارای ۲ میلیگرم در لیتر BAP و ساکارز ۶% و دوره نوری ۸ ساعتی بیان کردند. هم چنین نشان دادند زمانی که BAP و CCC تامین باشد ساکارز ۶% برای غدهزایی بهینه است.
اسکیلد-رنتاسکلر و اسکمیدیش در سال (۱۹۸۴) از محیطهای MS دارای سایتوکینین ۱۴-۱۰ میلیگرم در لیتر و ساکارز ۶ تا ۸% برای ریز غدهزایی استفاده کردند و دریافتند در صورت عدم استفاده از سیتوکینین به عنوان محرک غدهزایی میبایست از دوره های نوری بلند با شدت زیاد و در صورت استفاده از سیتوکینین میبایست از دوره کوتاه نوری با شدت کم و یا تاریکی پیوسته استفاده کرد.
وانگ و هو در سال (۱۹۸۵) در آزمایشات خود جهت تولید گیاهچه حاصل از ساقه، ابتدا غدهها را با آب معمولی شسته سپس در محلول هیپوکلریت کلسیم[۱۱۵] ۱% به مدت ۱۰ دقیقه خیسانده و بعد با آب مقطر استریل شستشو دادند. پس از ضدعفونی، جهت شکستن رکود جوانه ها غدهها را به مدت یک ساعت در محلول ۰۳/۰ میلیمول GA3 فرو برده سپس بر روی کاغذ صافی قرار دادند و در زمانهای مختلف با محلول یک میلیمول کلرید کلسیم آنها را مرطوب میکردند. جهت رشد ساقه، غدهها را در حرارت ۱۸ درجه سانتی گراد قرار داده و پس از رشد آنها را به قطعاتی که دارای یک جوانه جانبی باشد، تقسیم کردند. برای کشت قطعات سیبزمینی از محیط کشت MS محتوی ۱/۰ میلیگرم در لیتر GA3 و ۳% ساکارز استفاده شد. سپس جهت رشد در فتوپریود ۱۶ ساعته با شدت نور ۴-۳ کیلولوکس و دمای ۲۵-۲۲ درجهسانتی گراد قرار گرفتند.
تاور و همکاران در سال (۱۹۸۵) روش جدیدی جهت تولید غده در شرایط درون شیشه ارائه کردند. آنها در این روش از ۳ مرحله استفاده کردند: