- لوله زایا
- مورفولوژی بررسی ایجاد کلامیدوکونیدی در روی کورن میل آگار
- رشد در دماهای ۴۲ و ۴۵ درجه سانتی گراد
- بررسی ایجاد کلامیدوکونیدی در کازئین آگار
- جذب کربوهیدراتها
- واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR و RAPD
تشخیص های غیر مولکولی بر اساس آزمون های مورفولوژی وبیوشیمیایی به شرح زیر میباشد:
۳-۲-۴-۱) بررسی پرگنه در محیط کروم آگارکاندیدا:
از تمامی نمونه های جمع آوری شده که بر روی سابورو دکستروز آگار حاوی کلرامفنیکل کشت داده شده بودند بر روی محیط کروم آگار کشت خطی داده شدند و پس از محکم کردن اطراف پلیت ها با چسب آنها را در دمای ۳۰ درجه سانتی گراد به مدت ۷۲-۴۸ ساعت در داخل گرم خانه نگه داری شدند. بر اساس رنگ وفرم ایجاد شده در محیط کروم آگار یک تشخیص احتمالی در نظر گرفته شد، پرگنه هایی که ایجاد رنگ سبز، سبز روشن یا سبزآبی و سبز تیره نموده اند کاندیدا آلبیکنس در نظر گرفته شدند. وبرای تایید بیشتر از روش های زیر استفاده شد. ( شکل-۷ )
- طرز تهیه محیط کروم آگار کاندیدا:
در یک ارلن حدود ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر می ریزیم آن را اتوکلاو می کنیم. ۱/۲ گرم پودر کروم آگار را که از قبل آماده شده در کنار شعله یا هود تمیز به آب اضافه می کنیم و می جوشانیم. سپس محیط را به پلیت های استریل وارد می کنیم و در یخچال نگهداری می کنیم.
شکل ۳– ۷ : وجود کاندیدا آلبیکنس در محیط کروم آگار
۳-۲-۴-۲) آزمایش ایجاد لوله زایا :
این آزمایش از اولین روش های تشخیص کاندیدا آلبیکنس محسوب می شده است. در طی این آزمایش، بخشی از پرگنه تازه رشد یافته برروی محیط سابورودکستروز آگار( Merck ) در نیم میلی لیتر سرم تازه انسان (گاو، گوساله، اسب یا خرگوش) و در یک لوله همولیز به حالت سوسپانسیون در آمد. سوسپانسیون حاصل به مدت ۳ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه شد. پس از طی زمان انکوباسیون قطره ای از سوسپانسیون مورد نظر در زیر میکروسکوپ بررسی گردید.
۳-۲-۴-۳)مورفولوژی و بررسی کلامیدوکونیدی بر روی کورن میل آگار( CMT80 ) :
بسیاری از قارچها قادر به ایجاد کلامیدوکونیدی هستند، اما در بحث مخمر ها یک ملاک تشخیصی محسوب می شود. کاندیدا آلبیکنس قادر به ایجاد کلامیدوکونیدی می باشد.
برای بررسی ایجاد کلامیدوکونیدی از محیط های کورن میل آگار و یا دانه برنج حاوی توئین۸۰ استفاده می شود. توئین ۸۰ ایجاد کلامیدوکونیدی را تشدید می کند. در مطالعه حاضر از محیط کورن میل آگار حاوی یک درصدتوئین۸۰ استفاده شد.
طرز تهیه محیط کورن میل اگار حاوی توئین۸۰ :
۱۷ گرم از پودر محیط کورن میل اگار ( HIMEDIA ) در یک لیتر آب مقطر مخلوط شد و سپس برای آنکه کاملاً حل شود به دمای جوش رسانده شد سپس ۱۰ میلی لیتر از توئین ۸۰ ( Merck ) به آن اضافه شد و در دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد به مدت ۱۵ دقیقه اتوکلاو ( Jorgensen Germany ) گردید. پس از آن در پلیت های یک بار مصرف استریل پخش شد.
پس از آماده سازی محیط، از پرگنه های مخمری تازه رشد کرده در محیط SDA با یک آنس استریل برداشت کرده و بصورت شیار های کم عمق وموازی درمحیط کورن میل اگار کشت داده شد و در دمای ۲۵ تا۳۰ درجه سانتی گراد به مدت ۲۴ تا ۴۸ ساعت انکوبه گردید. پس از طی زمان انکوباسیون در زیر میکروسکوپ از نظر وجود میسلیوم های کاذب و حقیقی و کلامیدوکونیدی (کلامیدوسپور) و بلاستوکونیدی بررسی گردید.
۳-۲-۴-۴)بررسی ایجاد کلامیدوکونیدی در محیط کازئین اگار:
تمام مخمر های مورد بررسی و نمونه های استاندارد ابتدا روی محیط گلوکز آگار به مدت ۴۸ ساعت و در دمای ۳۰ درجه سانتی گراد کشت داده شدند. سپس نمونه های کشت داده شده با استفاده آنس یا لوپ به صورت شیار های کم عمق و موازی بر روی محیط کازئین آگار تلقیح و به مدت ۴۸ ساعت و در دمای ۲۴ درجه سانتی گراد نگهداری شدند. پس از طی مدت انکوباسیون نمونه هایی از کشت تهیه و با لاکتوفنل کاتن بلو رنگ آمیزی شدند و از نظر ایجاد کلامیدوکونیدی در زیر میکروسکوپ نوری بررسی شدند.
- روش تهیه محیط کازئین اگار:
۱۰ گرم از محیط Skim Milk در ۹۰ میلی لیتر آب مقطر حل گردید. به طور جداگانه ۳ گرم آگار نیز در۹۷ میلی لیتر آب حل شد. سپس هر کدام در دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد به مدت ۱۵ دقیقه اتوکلاو گردیدند. پس از سرد شدن تا دمای ۴۵ تا۵۰ درجه سانتی گراد هر دو محلول با هم مخلوط گردیدند و در پلیت های یک بار مصرف استریل پخش و پس از بستن محیط مورد استفاده قرار گرفت.
۳-۲-۴-۵) رشد در دمای ۴۵ درجه سانتی گراد :
این آزمایش بر روی تمام جدایه هایی که در محیط کروم آگار رنگ سبز روشن، سبز تیره یا سبز آبی ایجاد کرده بودند انجام گرفت. جدایه های مورد نظر در محیط SDA کشت داده شدند و به مدت ۴۸ ساعت در دمای ۳۰ درجه نگهداری شدند. سپس بخش کوچکی از پرگنه رشد یافته مجددا بر روی محیط SDA دیگری بطور خطی کشت داده شد ودر دمای ۴۵ درجه انکوبه گردید و در زمان های ۲۴و۴۸ ساعت از نظر رشد بررسی شدند.
۳-۲-۴-۶) واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR و RAPD :
استخراج DNA از جدایه های مخمری:
برای استخراج DNA، از نمونه های رشد یافته در محیط کشت SDA استفاده شد. کلیه مراحل استخراج در شرایط استریل و زیر هود مناسب انجام گرفت.
مواد لازم:
۱- بافر لیز کننده Lysis buffer
Tris HCL 400 mM (Merck)
EDTA 60 mM (Merck)
Na Cl 150 mM (Merck)
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) 1% (Merck)
که در نهایت باید به pH:8 رسانده شود.
۲- بافر استات پتاسیم
Potassium Acetate 5M 60cc (Merck)
Acetic acid glacial 11.5cc (Merck)
Distilled water 28.5cc
که در نهایت آن باید به pH:4.8 رسانده شود.
۳- پروتئیناز K
۴- ایزوپوپیل الکل
۵- اتانول ۷۰ درصد
۶- دانه های شیشه ای ۵/۰ میلیمتری Glass beads
بخشی از پرگنه رشد یافته در محیط SDA ( به اندازه یک عدس) را در ۵۰۰ میکرولیتر آب مقطر استریل درون میکروتیوب های اپندورف حل می گردد و سپس جهت شستشو و پاک سازی از بقایای محیط کشت بمدت یک دقیقه در دورg × ۱۰۰۰۰ سانتریفوژ می شود.
-در مرحله بعد بر روی رسوب حاصل ۵۰۰ میکرولیتر از بافر لیز کننده و حداقل دو برابر حجم پرگنه Glass beads اضافه می گردد. پس از انجام دو مرحله ورتکس به مدت ۳۰ تا ۶۰ ثانیه به میزان ۱۰ میکرولیتر پروتئیناز K به لوله های اپندورف افزوده می شود. سپس دو تا سه مرحله ورتکس (۳۰ تا ۶۰ ثانیه)(شکل-۸) و در هر مرحله یک بار انجماد سریع در دمای ۷۰- درجه سانتی گراد انجام می شود.
شکل۳- ۸ : مرحله ورتکس در استخراج DNA
- پس از انجام این مراحل که به منظور شکست دیواره سلولی قارچ انجام می شود، میکروتیوب ها به مدت ۵ دقیقه در دمای ۶۰ درجه سانتی گراد قرار داده می شود.
- ۱۵۰ میکرولیتر بافر استات پتایسم به لوله ها افزوده می شود و به آرامی تکان داده می شود. بهتر است افزودن بافر استات پتاسیم در دو مرحله انجام پذیرد(جهت رسوب بهتر بقایای سلولی و پروتئین ها) و سانتریفوژ در دورg × ۱۰۰۰۰ بمدت یک دقیقه انجام میگیرد.
- مایع روئی حاصل به لوله های جدید اپندورف انتقال داده می شود.
- در این مرحله به اندازه حجم مساوی با سوپرناتانت، ایزوپروپیل الکل سرد اضافه می شود و به آرامی تکان داده می شود. (جهت رسوب دادن DNA ) و در دورg × ۱۰۰۰۰ بمدت ۲ دقیقه سانتریفوژ می شود.
- جهت پاک سازی DNA استخراج شده از بقایای ایزوپروپیل الکل، ۵۰۰ میکرولیتر الکل ۷۰ درجه به رسوب حاصل از مرحله قبل اضافه می گردد و در در دورg × ۱۰۰۰۰ بمدت ۱ دقیقه سانتریفوژ می شود.
