C=درصد مرگ و میر در شاهد
از آن‌جائی که در این آزمون غلظت هایی که صفر درصد و صد درصد تلفات را ایجاد می‌کند مناسب نیست، اولین دزی که بیش از ۱۰ درصد تلفات را ایجاد کرد بعنوان پائین‌ترین دز و دزی که حدود ۸۰ درصد تلفات را ایجاد نمود بعنوان بالاترین دز مؤثر برای انجام آزمایش‌های اصلی انتخاب شدند. دزهای بین آن‌ها از طریق قرار دادن در فرمول زیر بصورت فاصله‌ی لگاریتمی بدست آمدند. در مجموع پنج غلظت از هر عصاره به همراه یک شاهد استفاده شد.

A و E به ترتیب بالاترین و پائین‌ترین غلظت‌ها، B و C و D غلظت‌های بین آن‌ها هستند. همچنین a مقدار ثابت برای تمام غلظت‌ها و n برابر با تعداد غلظت‌ها می‌باشد. گیاهان کلزا پس از اسپری شدن توسط دستگاه برج ‌سم‌پاش تقریباً به صورت یک‌ساعت و قبل از ورود شته‌ها در دمای اتاق نگهداری شدند تا اینکه حلال بطور کامل از سطح برگ ها بخار شود. شته‌ها توسط قلم‌ موی بسیار ریز و با دقت کامل روی گیاهان کلزا منتقل شدند و تا زمان شمارش در اتاقک رشد با دمای ۱±۲۵ درجه‌ی سانتی‌گراد و رطوبت نسبی ۵±۷۰ درصد نگهداری شدند. آزمایشات زیست‌سنجی در این مرحله روی زنبورهای پارازیتوئید به همین شکل انجام گردید. بدین صورت که عصاره‌ها در غلظت‌های معین توسط دستگاه برج‌سم‌پاش در پتری‌دیش‌های پوشیده شده با کاغذ صافی پاشش‌شدند و پس از بخار شدن حلال زنبورهای همسن توسط آسپیراتور^[۸۱] (شکل۳-۱۰) جدا سازی شده و داخل این پتری دیش‌ها قرار گرفتند. در هنگام استفاده از آسپیراتور دقت شد که به آرامی زنبورها منتقل شوند تا از هر گونه آسیب‌زدن به آن‌ها جلوگیری به عمل آید، در صورتیکه مشاهده می‌شد یکی از زنبورها صدمه دیده باشد توسط یک زنبور سالم جایگزین گردید. پتری‌دیش‌ها تا ز مان شمارش افراد مرده در اتاقک رشد با دمای ۱±۲۵ درجه‌ی سانتی‌گراد ، رطوبت‌نسبی ۵±۷۰ درصد قرار گرفتند. ظروف پتری مورد استفاده دارای قطر هشت سانتی‌متر و عمق‌ یک سانتی‌متر بودند و برای ایجاد تهویه‌ی کافی سوراخی روی درب پتری‌ها ایجاد شده بود که با توری ‌مش ‌ریز پوشانده شده بود تا در ضمن از فرار حشرات نیز جلوگیری گردد (شکل ۳-۱۱).
پس از گذشت ۲۴ ساعت از شروع آزمایش میزان تلفات در تیمارهای مختلف یادداشت شده و بوسیله‌ی نرم افزار SAS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفته و دزهای کشنده محاسبه گردید.
شکل ۳-۸ دستگاه Potter spray tower مورد استفاده در آزمایشهای زیست سنجی
شکل ۳-۹ آسپیراتور مورد استفاده جهت انتقال زنبورهای D. rapae
شکل ۳-۱۰ پتری دیش های استفاده شده در آزمایش های زیست سنجی
۳-۴-۳- زیست‌سنجی حشرات با عصاره روناس
جهت انجام آزمایش‌ها از عصاره‌ی متانولی روناس استفاده شد. پس از انجام تست مقدمانی و بدست‌آوردن فاصله دزها برای انجام تست اصلی از پنج غلظت به همراه شاهد استفاده گردید و در هر غلظت چهار تکرار و در هر تکرار ۱۵ عدد حشره‌ی هم سن استفاده شدند این حشرات همگی در اتاقک رشد (شکل ۳-۱۲) با شرایط دما و رطوبت ذکر شده در قبل به مدت ۲۴ ساعت قرار گرفتند و پس از اتمام دوره در هر تکرار تلفات شمارش گردیده و ثبت شدند.
۳-۴-۴- زیست‌سنجی حشرات با عصاره‌ی کلپوره
جهت انجام آزمایش‌ها از عصاره‌ی متانولی کلپوره استفاده شد. پس از انجام تست مقدمانی و بدست‌آوردن فاصله دزها برای انجام تست اصلی از پنج غلظت به همراه شاهد استفاده گردید و در هر غلظت چهار تکرار و در هر تکرار ۱۵ عدد حشره‌ی هم سن استفاده شدند این حشرات همگی در اتاقک رشد با شرایط با شرایط دما و رطوبت ذکر شده در قبل به مدت ۲۴ ساعت قرار گرفتند (شکل ۳-۱۲) و پس از اتمام دوره در هر تکرار تلفات شمارش گردیده و ثبت شدند.
شکل ۳-۱۱ اتاقک رشد مورد استفاده در آزمایشهای زیست سنجی
۳-۵- بررسی دز زیر کشنده‌ی عصاره‌ها
در این آزمایش‌ها برای بررسی دز زیر کشنده‌ی عصاره‌های روناس و کلپوره روی رفتار و بیولوژی زنبور پازازتیوئید D.Rapae از غلظت LC₂₅ هر کدام از عصاره‌ها استفاده گردید و تأثیر هر کدام از عصاره‌ها روی رفتار میزبان‌یابی، طول‌عمر ، درصد پارازیتیسم، درصد تفریخ و نسبت‌جنسی نسل بوجود آمده از زنبورهای تیمار شده بررسی گردید.
۳-۵-۱- باروری زنبورها:
قبل از انجام آزمایش‌های این قسمت زنبورهای ماده به مدت ۲۴ تا ۳۶ ساعت در کنار زنبورهای نر نگهداری شدند تا اطمینان حاصل شود که عمل جفت‌گیری انجام شده است. پس از اتمام این مرحله زنبورهای ماده بطور جداگانه در لوله‌های آزمایش ‌به مدت ۱۲ ساعت قبل از انجام آزمایش نگه‌داری شدند زنبورها در طی این مدت بوسیله‌ی آب‌مقطر و عسل تغذیه می‌شدند. عسل روی نوارهای بسیار باریک کاغذ بصورت قطرات بسیار ریز که با نوک‌ سوزن قرار داده شده بود در اختیار زنبورها قرار می‌گرفت و آب ‌مقطر نیز بوسیله‌ی پنبه‌ی نم در اختیار زنبورها قرار گرفت. کاغذ حاوی قطرات ریز آب عسل ۵۰ درصد طوری تا زده شد تا از گیر افتادن زنبورها حتی‌الامکان جلوگیری شود. در پایان این دوره زنبورهای ماده‌ی تغذیه کرده که تا کنون با میزبان خود تماسی نداشتند وارد پتری‌های حاوی کاغذ صافی تیمار شده توسط غلظت‌های زیرکشنده‌ی عصاره‌های روناس و کلپوره و نیز شاهد شدند ( از حلال به عنوان شاهد استفاده گردید).
در این قسمت حشرات به مدت ۱۲ ساعت در معرض دز زیر کشنده قرار گرفتند. در این آزمایش پنج تکرار برای هر تیمار که شامل ۲۰ زنبور ماده‌ی هم سن جفت‌گیری کرده بود وجود داشت. پس از اتمام ۱۲ ساعت پتری‌‌ها به دقت باز شده و زنبورهای زنده مانده به آرامی توسط آسپیراتور وارد لوله‌های آزمایش که محتوی آب و عسل برای تغذیه‌ی آن‌ها بودند ‌،شدند. و تا زمان انجام آزمایش در اتاقک رشد با دمای ۱±۲۵ درجه‌ی سانتی‌گراد و رطوبت نسبی ۵±۷۰ درصد قرار گرفتند. به منظور انجام آزمایش‌های باروری ۱۰ زنبور ماده زنده مانده از هر کدام از تیمارها بصورت تصادفی انتخاب شده و هر کدام بطور جداگانه وارد پتری‌‌هائی شدند که هر کدام حاوی ۵۰ شته‌ی بالغ بر روی گیاهان کلزا بودند. پتری‌ها روی درب خودشان دارای یک سوراخ تقریباً ۵/۲ سانتی‌متری بودند که توسط توری با مش‌ریز پوشانیده شده بود تا عمل تهویه‌ به خوبی انجام شود. هر کدام از زنبورها به مدت ۴۸ ساعت در کنار شته‌ها نگهداری شدند پس از ۴۸ ساعت زنبورها حذف گردیده و پتری‌‌ها بر چسب‌خورده و به مدت ۲۰ روز در نگهداری شدند. در پایان دوره تعداد شته‌های پارازیته شده، درصد تفریخ و نسبت‌جنسی نسل تازه‌ی بوجود آمده برای هر تیمار یادداشت گردید.
۳-۵-۲- طول عمر زنبورهای بالغ
زنبورهای بالغ طبق پروسه‌ی ذکر شده در مرحله‌ی قبل در معرض دز زیرکشنده‌ی عصاره‌های روناس و کلپوره قرارگرفتند. پس از گذشت یک ساعت زنبورهای تیمار شده بصورت مجزا وارد پتر‌ی‌‌های حاوی آب عسل شدند و در اتاقک رشد قرار گرفتند. پارازاتیوئیدها بصورت روزانه مورد بازدید قرار گرفتند و این کار تا زمان مرگ تمام زنبورها ادامه یافت. در طی این مدت در صورت لزوم آب و عسل جدید در اختیار زنبورها قرار گرفت. در این مرحله ۲۱ تکرار برای عصاره روناس و ۲۳ تکرار برای عصاره ی کلپوره و شاهد مورد استفاده قرار گرفت.
۳-۵-۳- بررسی رفتار میزبان‌یابی زنبورهای ماده
زنبورهای پارازاتیوئید ماده که در معرض دز زیرکشنده‌ی هر کدام از عصاره ها طبق پروسه‌ی ذکر شده قرار گرفته بودند، بصورت جداگانه و توسط آسپیراتور وارد لوله های آزمایش با قطر ۱۰ میلی‌متر و طول ۶ سانتی‌متر شدند و به مدت ۱۲ ساعت تا قبل از انجام آزمایش بویائی­سنجی نگهداری شدند. پاسخ‌های رفتاری زنبورهای D. Rapae نسبت به گیاهان آلوده به شته‌های مومی‌کلم در یک دستگاه بویائی‌سنج با دو لوله‌ی باز به طول ۵۷ سانتیمتر و ابعاد ۵ در ۵ سانتیمتر مورد بررسی قرار گرفت. در هر کدام از لوله‌ها جریان هوا توسط فن‌های تعبیه شده در انتهای لوله‌ها به قسمت وسطی بویائی‌سنج جریان پیدا می‌کرد. بین فن‌های به کار رفته در این دستگاه و قسمت میانی دستگاه (محل رهاسازی) محفظه‌ای تعبیه شده بود که به منظور قرار دادن گیاهان کلزای آلوده به شته به کار می‌رفت و به منظور عدم تداخل نور در انجام آزمایش‌های بویائی سنجی، همه‌ی آزمایش‌ها در تاریکی انجام گردید و برای تامین نور مورد نیاز برای ثبت مشاهدات از یک منبع نوری قرمز رنگ که در بالای دستگاه تعبیه شده بود استفاده گردید (شکل ۳-۱۳).
در هر کدام از آزمایش‌ها فقط در یکی از لوله‌های دستگاه بویائی‌سنج گیاهان کلزای آلوده به شته مومی‌کلم B.brassicae ،‌قرار می‌گرفت در حالیکه لوله‌ی دیگر که هوای خالص در آن جریان داشت بعنوان شاهد در نظر گرفته شد. سعی شد به منظور دقت بیشتر آزمایشات همه‌ی بررسی‌ها در یک زمان معین از روز انجام شود.
برای انجام آزمایشات بویائی سنجی از ذغال اکتیو در بازوها به منظور از بین بردن هر گونه بوی‌ محیط در دستگاه استفاده شد. به منظور انجام این آزمایش یک زنبور پارازتیوئید ماده به دقت وارد محفظه‌ی میانی دستگاه بویائی‌سنج شد و الگوی حرکتی زنبور به مدت ۱۰ دقیقه مشاهده و ثبت گردید. به هر کدام از پارازتیوئیدها ۱۰ دقیقه وقت داده شد تا یکی از لوله‌های دستگاه بویائی‌سنج را انتخاب کنند، پس از اتمام ۱۰ دقیقه چه انتخابی انجام شده بود چه انجام نشده بود زنبور حذف می‌شد. زمانی که یک زنبور از نیمه‌ی هر کدام از لوله‌های بویائی‌سنج عبور می‌کرد، انتخاب آن بازو برایش ثبت می‌شد. برای انجام آزمایش‌های این قسمت ۱۰ تکرار از هر تیمار و ۱۰ تکرار بعنوان شاهد انتخاب گردیده و داده‌ها بوسیله‌ی نرم‌افزار SAS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.
شکل ۳-۱۲ دستگاه بویایی سنج استفاده شده در آزمایش های رفتاری زنبور D. rapae
فصل چهارم
نتایج
۴-۱- آزمایشهای زیست سنجی
۴-۱-۱- تعیین حلال مناسب برای عصاره ها
نتایج تاثیر حشره­کشی عصاره­های گیاهی استخراج شده توسط دزهای مختلف از گیاهان مورد استفاده روی شته مومی کلم و زنبور پارازیتویید آن در جدول های ۴-۱ و ۴-۲ ارائه شده است. از بین این عصاره ها، عصاره هایی که بیش از ۵۰ درصد تلفات را روی حشرات ایجاد کردند برای مرحله دوم انتخاب شدند.
همانطور که از جداول می توان فهمید روی هر دو حشره عصاره های متانولی روناس و کلپوره در غلطت ۳۰۰ میکرولیتر بر میلی­لیتر، تلفات بیشتر از ۵۰ درصد را ایجاد کردند و درنتیجه برای آزمایش های زیست سنجی انتخاب گردیدند.
۴-۱-۲- آزمایش های مقدماتی
جهت تعیین غلظت مناسب عصاره­های انتخابی به منظور بررسی اثرات آنها روی شته B. brassicae و دشمن طبیعی آن D. rapae یکسری آزمایش­های مقدماتی روی حشرات کامل همسن انجام گرفت. بر این اساس، غلظت ۸۰۰ میکرولیتر بر میلی لیتر از عصاره های گیاهی که در هر دو مورد توانستند بیش از ۸۰ درصد تلفات را ایجاد کنند به منظور آزمایش های زیست سنجی مورد استفاده قرار گرفتند. نتایج تاثیر حشره­کشی عصاره­های گیاهی در این غلظت روی حشرات کامل شته در جداول ۴-۳ و ۴-۴ آمده است.