فصل دوم
مروری بر منابع
و بررسی مطالعات انجام شده
۲-۱- بررسی اثرات متفاوت عصاره گیاه زیتون تلخ روی حشرات
استفاده از گیاهان حشره کش‌ از سال ۱۸۵۰ با سموم گیاهی، مانند نیکوتین و روتنون آغاز گردیده و تاکنون نتایج بسیار خوبی از نحوه کنترل آفات با ترکیبات گیاهی بدست آمده است (Chaubey, 2007). برخی از گیاهان از ترکیباتی تشکیل شده ‌اند که این ترکیبات می‌ توانند حشرات آفات را از محصولات گیاهی دور کنند و خسارت اقتصادی آن ‌ها را کاهش دهند. برای مثال گیاه سیر^[۱۸]، آفاتی مانند سوسک ژاپنی، شته ‌ها،‌ سرخرطومی ‌های سبزیجات و کنه ‌های تارتن عنکبوتی را دور می‌کند (Zehnder, 2004). در گذشته برگ‌ های درخت عرعر^[۱۹] و تمام اندام ‌های گیاه سریشک^[۲۰] علیه شته ‌ها مورد استفاده قرار می‌گرفت (Pascual-Villalobos and Robledo, 1999).

مشتقات درخت زیتون تلخ به عنوان حشره کش تشخیص داده شده است. میوه ‌های این گیاه، باعث تأخیر در رشد، ‌کاهش باروری، نقص‌ های مورفولوژیکی و تغییرات رفتاری در حشرات می ‌شود (Senthil Nathan and Sehoon, 2006). از عصاره درخت زیتون تلخ به عنوان یک ترکیب ضد تغذیه، ‌دور کننده و تنظیم کننده رشد در حشرات استفاده شده است (Reed et al.,1982).
در پژوهشی، اثر عصاره‌ های متانولی Azadirachta indica و Melia azedarach روی تخم ‌ریزی و تفریخ تخم ‌های پروانه Earias vittella F. مورد ارزیابی قرار گرفتند (Gajmer et al., 2002). در مطالعه ‌ای دیگر بررسی تأثیر حشره کشی‌ عصاره آبی برگ و میوه رسیده زیتون تلخ روی مرحله پورگی سفید بالک گلخانه^[۲۱] صورت گرفت (Jazzar and Abou-Fakhar, 2003). همچنین تأثیر عصاره اتانولی دانه زیتون تلخ روی شته جالیز^[۲۲] و شته سبز هلو^[۲۳] بررسی شد (سالاری و همکاران ،a 1390).
در مطالعه ای آزمایشگاهی، تأثیر عصاره آبی زیتون تلخ بر روی فعالیت ‌های زیستی لارو پروانه Spodoptera frugiperda بررسی شد (Carvalho and Ferreira, 1990). همچنین اثرات ضد تغذیه ‌ایی عصاره آبی گل، میوه، ساقه و برگ گیاه زیتون تلخ روی Diabrotca speciosa بررسی گردید (Ventura and Ito, 2000). در تحقیقی دیگر، اثرات دورکنندگی و ضد تغذیه ایی برگ، میوه رسیده و میوه نارس زیتون تلخ روی سفید بالک گلخانه گزارش شده است (Abou Fakhr et al., 2001; Nardo et al., 1997). دز زیرکشنده عصاره میوه رسیده زیتون تلخ نیز توسط دفاگو^[۲۴] و همکاران (۲۰۰۹) بررسی شده است. به علاوه گزارش شده است که عصاره برگ زیتون تلخ، در بقای لارو و حشرات بالغ Epilachna paenulata تأثیر دارد (Kraus et al., 1986). در تحقیقی دیگر، تأثیر عصاره برگ زیتون تلخ، روی رشد و دگردیسی E. varivesti بررسی شد (Zhu and Ermel, 1991). تأثیر عصاره بدست آمده از برگ و میوه نارس زیتون تلخ روی مرگ و میر حشرات بالغ سفید بالک گلخانه به اثبات رسیده است (Nardo et al., 1997).
دهقانی و احمدی (۱۳۹۰) تأثیر عصاره متانولی زیتون تلخ روی مراحل مختلف زیستی سفید بالک گلخانه^[۲۵] را‌، در شرایط آزمایشگاهی مورد بررسی قرار دادند. اثرات حشره‌کشی دو عصاره گیاهی، شامل دانه گیاه زیتون تلخ و اسفند روی تریپس پیاز^[۲۶]، در شرایط آزمایشگاه توسط نجمی ‌زاده و احمدی (۱۳۹۰) مورد مطالعه قرار گرفته است. در پژوهشی دیگر، اثر عصاره اتانولی گیاه زیتون تلخ روی تغذیه لارو و حشره کامل سوسک برگخوار نارون Xanthogalleraca luteola Mulle (Coleoptera: Chrysomelidae) بررسی شد (Valladares et al., 1997).
انواع گوناگونی از عصاره های خام بخش های متفاوت گیاه زیتون تلخ از جمله عصاره برگ و میوه رسیده آن، برای ارزیابی فعالیت های ضدتغذیه ایی برخی حشرات شامل راسته های Saltatoria، Heteroptera، Homoptera، Coleoptera، Lepidoptera و Diptera استفاده شده است (Ascher et al., 1995). عصاره برگ زیتون تلخ همچنین، تخم ریزی پشه Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) را کاهش داد (Defago et al., 2009)؛ این در حالی است که در تحقیقی دیگر، مشخص شد که عصاره میوه رسیده زیتون تلخ، اثری روی تخم گذاری پشه A. aegypti ندارد (Coria et al., 2008). همچنین اثرات قوی ضد تخم گذاری عصاره زیتون تلخ، روی ماده های Anopheles stephensi گزارش شده است (Senthil Nathan et al., 2006)؛ اگرچه در این تحقیق اثر عصاره میوه رسیده زیتون تلخ به مراتب بیشتر از عصاره برگ بود.
دفاگو و همکاران (۲۰۰۹) نشان دادند که عصاره زیتون تلخ روی تخم ریزی E. paenulata تأثیر دارد. در پژوهشی دیگر، اثر عصاره برگ زیتون تلخ روی مرگ و میر، طول دوران لاروی و سرعت رشد Spodoptera frugiperda بررسی شد (De Brito et al., 2004; McMillian et al., 1969). تأثیر عصاره های قسمت های مختلف رشدی زیتون تلخ شامل میوه نارس و رسیده، برگ و ساقه، روی مرگ و میر سفید بالک به اثبات رسیده است (De Souza and Vendramin, 2001). همچنین گزارش شده است که عصاره آبی میوه رسیده زیتون تلخ، روی گونه های مختلف شته ها تأثیر دارد (Defago et al., 2009).
همچنین فعالیت ضد تغذیه ای آزادیراختین استخراج شده از دانه های زیتون تلخ علیه لارو Spodoptera exiguae به اثبات رسیده است (Huang et al., 1995). بررسی تأثیر عصاره اتانولی گیاه زیتون تلخ بر روی آفت سرخرطومی برنجL. Sitophilus oryzae نیز بیانگر خاصیت حشره کشی این عصاره گیاهی در ارتباط با این آفت است (Panji, 1946). اثرات عصاره اتانولی زیتون تلخ روی لارو شب پره Pieris brassicae و سوسک Aulacophora foveicollis بررسی گردید (Saljoqi et al., 2006). مطالعات نشان داد که عصاره اتانولی زیتون تلخ برای کنترل لارو سن سوم و چهارم Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) تأثیر بسزایی دارد (Prophiro et al., 2008). همچنین خبیر و همکاران (۱۳۹۳) گل درخت زیتون تلخ را به عنوان شته کش معرفی کرده و تأثیر غلظت های مختلف عصاره اتانولی آن را روی مرگ و میر حشرات بالغ شته سیاه باقلا مورد بررسی قرار دادند.
۲-۲- بررسی اثرات حلال های مختلف روی حشرات
در امر استخراج ترکیبات مؤثر موجود در یک عصاره گیاهی، نوع حلالِ مورد استفاده جهت استخراج عصاره، در میزان اثر حشره کشی آن عصاره گیاهی نقش دارد. در یک تحقیق، تأثیر نوع حلال و تکنیک عصاره گیری،‌ بر روی فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره برخی گیاهان دارویی بررسی شد (Sultana et al., 2009). در آزمایشی دیگر، جهت تعیین تأثیر نوع حلال بکار رفته در تهیه عصاره دانه گیاه زیتون تلخ، ‌روی خاصیت حشره کشی عصاره ‌های استخراج شده، بر روی شته سیاه باقلا مورد بررسی قرار گرفت (سالاری و همکاران، b1390).
۲-۳- استخراج از گیاهان به کمک روش های نوین استخراج
در پژوهشی با کمک امواج مایکروویو، استخراج ترپن ها از دانه های زیره انجام شد (Chemat et al., 2005). استخراج پلی فنول ها^[۲۷] از پوست پرتقال^[۲۸] با کمک امواج فراصوت صورت گرفت و استخراج طی مدت زمان ۳۰ دقیقه انجام شد (Kamran Khan, 2010). کاربرد فراصوت در تکنولوژی مواد غذایی (پردازش، حفظ و استخراج) توسط چمت^[۲۹] و همکاران (۲۰۱۱) بررسی شد. همچنین روش های متداول و جدید در زمینه استخراج مواد غذایی از گیاهان، از جمله استخراج سوکسله، استخراج با کمک امواج مایکروویو و استخراج با کمک امواج فراصوت مورد بررسی قرار گرفته اند (Wang and Weller, 2006).
در آزمایشی اثر روش های مختلف استخراج بر راندمان استخراج روغن از پوست درخت Pinus radiata، مورد مطالعه قرار گرفت (Aspe and Fernandez, 2011). استخراج روغن از دانه های کتان با کمک امواج فراصوت نیز، توسط زانگ^[۳۰] و همکاران (۲۰۰۸) انجام پذیرفت.
فصل سوم
مواد و روش ها
۳-۱-کشت گیاه میزبان
پس از زهکشی گلدان‌ های پلاستیکی (با قطر ۱۰ سانتی‌ متر) با سنگ ‌ریزه، ‌این گلدان ‌ها با مخلوطی از ماسه بادی و کود گیاهی پوسیده (خاک برگ) پر شدند. سپس درون هر گلدان (با توجه به اندازه بذر ها و حجم‌ گلدان)، چند بذر باقلا کاشته و همواره سعی شد که عمق مناسب کاشت رعایت گردد. به منظور جلوگیری از آلودگی گیاهان مذکور به آفاتی نظیر کنه ‌ها، ‌تریپس ‌ها و یا شته‌ ها، گلدان ‌های باقلا پس از کشت، ‌در داخل قفس ‌های چوبی یا فلزی با ابعاد ۸۰×۶۰×۶۰ سانتی‌ متر که با تور ارگانزا و یا حریر پوشیده شده بودند، ‌درون گلخانه در شرایط دمایی ۵±۲۵ درجه سانتی‌گراد، رطوبت نسبی ۱۰±۶۰ درصد و ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی قرار داده شدند (شکل ۶). هر دو روز یکبار،‌ گلدان ‌ها آبیاری شده و زمانی که به مرحله چند برگی رسیدند (تقریباً پس از ۲ هفته)، برگ ‌های این گیاهان در آزمایشات استفاده گردید. لازم به ذکر است که در طول آزمایشات، ‌به طور متناوب،‌ تعدادی گلدان از گیاه باقلا کاشته شد (شکل ۷).
شکل ۶: تصویری از قفس ‌نگهداری گلدان ها در گلخانه (اصلی- Original)

شکل ۷: گیاهان باقلای کشت شده در گلخانه، جهت استفاده در آزمایشات (اصلی- Original)
۳-۲- پرورش حشرات
جهت بررسی تأثیر عصاره گیاهی،‌ حلال‌ های متفاوت و روش ‌های نوین استخراج عصاره از مراحل مختلف رشدی گیاه زیتون تلخ ‌در کنترل حشرات، از شته سیاه باقلا استفاده شد. به منظور پرورش آزمایشگاهی، شته مذکور، ‌از روی گیاهان میزبان در شهرستان کرمان جمع‌ آوری گردید. پس از انتقال شته ‌ها به آزمایشگاه و شناسایی آن ‌ها، یک کلنی از این شته پرورش داده شد. شته‌ ها درون ظروف مخصوص پرورش (ظروف پلاستیکی به قطر ۶ سانتی‌ متر و ارتفاع ۴ سانتی‌ متر، حاوی ژل آگار۷/۰ درصد)، برروی برگ ‌های باقلا پرورش داده شدند.
جهت تهیه ژل آگار ۷/۰ درصد، مقدار ۷ گرم از پودر آگار را داخل ۱۰۰۰ میلی‌ لیتر آب حل کرده و سپس این محلول به طور یکنواخت حرارت داده شد. پس از جوش آمدن و روشن ‌تر شدن رنگ محلول، محلول به میزان معین درون ظروف پرورش ریخته شد. پس از گذشت مدت زمان ۲۰ الی ۳۰ دقیقه، محلول درون ظروف پرورش به صورت ژل در آمده و قابل استفاده جهت پرورش حشرات و انجام آزمایشات شد. از محیط آگار ژل جهت حفظ رطوبت و نگهداری برگ‌ های گیاه میزبان برای مدت زمان طولانی تر استفاده گردید. داخل همه ظروف به طور معمول تعداد ۱۰ تا ۱۵ عدد شته بالغ جهت پرورش انبوه کلنی قرار داده و درب ظروف با توری های مخصوص (حریر شیشه‌ای برش خورده)، جهت تبادل هوا پوشانده شد. سپس ظروف پرورش در داخل اتاقک رشد^[۳۱] (شکل ۸)،‌ در شرایط دمایی ۱±۲۵ درجه سانتی‌گراد، رطوبت نسبی ۱۰±۵۰ درصد و ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی نگهداری شدند. درون اتاقک رشد جهت کنترل دقیق ‌تر تغییرات محیطی، از دستگاه رطوبت سنج (هیدرومتر) و دماسنج ماکزیمم-مینیمم استفاد شد. با پوره زایی شته ‌ها و افزایش جمعیت، ‌تعدادی از بالغین به ظروف پرورش جدید حاوی ژل آگار و برگ ‌های جدید گیاه‌ میزبان منتقل گردید (شکل ۹).

شکل ۸: اتاقک رشد و ظروف پرورش حشرات داخل آن (اصلی- Original)
شکل ۹: ظروف مخصوص پرورش شته سیاه باقلا (اصلی- Original)
برای بدست آوردن شته ‌های همسن، تعداد ۲۰۰ عدد شته بالغ از کلنی اولیه جدا و در یک کلنی جداگانه نگهداری گردیدند. پس از۲۴ ساعت، حشرات بالغ جدا شده و به کلنی اصلی بازگردانده شدند. در این حالت پوره ‌های ایجاد شده، یک یا دو روزه بوده که جهت انجام برخی از آزمایشات استفاده شدند (شکل ۱۰).
شکل ۱۰: پوره ۲-۱ روزه شته سیاه باقلا (اصلی- Original)
جهت آماده سازی پوره ‌های ۳ یا ۴ روزه، پوره‌ های یک یا دو روزه در کلنی جداگانه ‌ایی نگهداری شده و پس از ۴۸ ساعت، پوره ‌ها به سن سه یا چهار روزه رسیده و برای انجام آزمایشات مربوطه مورد استفاده قرار گرفتند (شکل ۱۱).
شکل ۱۱: پوره ۴-۳ روزه شته سیاه باقلا (اصلی-Original)
همچنین جهت آماده سازی بیوتست^[۳۲]، برای بررسی میزان پوره زایی ماده‌ های بالغ شته سیاه باقلا، ‌پوره ‌های ۲-۱ روزه درکلنی دیگری نگهداری شده،‌ پس از حدود ۷ روزه پوره‌ ها بالغ شده و سپس حشرات ‌تازه بالغ شده به محیط آزمایش منتقل شدند (شکل ۱۲).
شکل ۱۲: حشره تازه بالغ شده شته سیاه باقلا (اصلی-Original)
۳-۳- تهیه نمونه ‌های گیاهی
از زمستان ۱۳۹۱ تا اواخر پائیز ۱۳۹۲، ‌با توجه به نیاز، ‌مراحل متفاوت رشدی گیاه زیتون تلخ،‌ شامل گل، ‌میوه سبز کوچک (به قطر متوسط ۳ میلی متر)، میوه سبز بزرگ (به قطر متوسط ۷ میلی متر)، میوه رسیده و برگ، جهت انجام آزمایشات از رویشگاه طبیعی آن در منطقه ماهان (۵۷ درجه و ۹ دقیقه و ۳۰ ثانیه شرقی و ۳۰ درجه و۹ دقیقه و ۷۰ ثانیه شمالی، ارتفاع از سطح دریا ۱۷۹۴ متر) جمع آوری شدند.
نمونه های گیاهی پس از انتقال به آزمایشگاه، در شرایط مناسب (سایه و تهویه) خشک شدند. یک هفته پس از خشک شدن کامل اندام‌ های گیاهی، این قسمت ‌ها توسط آسیاب برقی استیل به مدت ۳ دقیقه کاملا پودر شدند. چون ماده مؤثر موجود در عصاره گیاه ممکن است قطبی، حد واسط و یا غیر قطبی باشد، جهت انجام آزمایشات از حلال ‌های قطبی (‌آب مقطرآزمایشگاهی، اتانول و متانول)، حلال حد واسط (‌استون) و حلال غیر قطبی (اِن هگزان) با درجه خلوص ‌های ۹۵ تا ۹/۹۹ درصد جهت عصاره گیری استفاده شد. همچنین به منظور بررسی تأثیر روش‌ های مختلف عصاره گیری از سه روش عصاره گیری به روش معمول و متداول (سنتی)، عصاره‌گیری با امواج مایکروویو و عصاره‌گیری با امواج فراصوت استفاده گردید.
۳-۴- تهیه عصاره ‌های گیاهی به روش عصاره‌گیری معمولی (سنتی)
در هر مرحله از عصاره گیری ۷۰ گرم از اندا‌م‌ های گیاهی پودر شده در ارلنی به حجم ۵۰۰ میلی‌ لیتر ریخته شد. با توجه به هدف و نوع آزمایش روی هرکدام از آن‌ ها به صورت مجزا از حلال‌ های فوق الذکر ریخته تا حجم مخلوط به ۱۵۰ میلی ‌لیتر رسید. پس از یک ساعت همزدن در زیر هود، درب ارلن با پارافیلم به خوبی بسته شد تا حلال از ظرف خارج نگردد. به منظور جلوگیری از تابش مستقیم نور به ارلن، دور آن با فویل آلومینیوم پوشانده شد. سپس مخلوط عصاره و باقی مانده گیاهی به مدت ۲۴ ساعت در یخچال (دمای ۴ درجه سانتی‌گراد)‌ نگهداری گردید.
پس از ۲۴ ساعت، عصاره گیاهی توسط کاغذ صافی Whatman N° ۹۱ از باقی ‌مانده‌ گیاهی جدا شد. در مراحل بعدی جهت انجام آزمایشات، غلظت ۵۰ میکروگرم در میلی ‌لیتر از عصاره ‌های فوق آماده سازی شده و مورد استفاده قرار گرفت (شکل ۱۳).

شکل ۱۳: یک نمونه از عصاره های استخراج شده به روش استخراج معمولی (اصلی-Original)
۳-۵- تهیه عصاره‌ های گیاهی به روش عصاره‌گیری با امواج مایکروویو
به منظور عصاره‌گیری از مراحل مختلف رشدی گیاه زیتون‌ تلخ با کمک امواج مایکروویو،‌ از آب مقطر به عنوان واسطه پراکندگی استفاده شد. زیرا نقطه جوش حلال ‌های دیگر که در بالا ذکر شد، نسبت به آب پایین‌ تر بوده و به سرعت در مایکروویو به جوش آمده و موجب ایجاد آتش سوزی می ‌شوند. جهت عصاره‌گیری، ‌۷۰ گرم از هرکدام از مراحل رشدی زیتون تلخ (گل، میوه‌ سبز کوچک، میوه سبز بزرگ، میوه رسیده و برگ) که کاملا پودر شده بودند،‌ درون ارلنی به حجم ۵۰۰ میلی ‌لیتر ریخته شد. سپس به آن ‌ها آب مقطر اضافه گردید تا حجم مخلوط به ۱۵۰ میلی‌ لیتر رسید. سپس هر ارلن‌ به طور جداگانه‌ درون مایکروویو قرار گرفت. هرکدام از مراحل گیاهی به صورت جداگانه، در مدت زمان های ۳۰ و ۵۰ ثانیه در معرض امواج مایکروویو قرار گرفتند. پس از عصاره‌گیری در مدت زمان ‌های ذکر شده،‌ مخلوط توسط کاغذ صافی Whatman N° ۹۱ فیلتر شد. جهت انجام آزمایشات، از هر کدام از عصاره‌ ها، غلظت ۵۰ میکروگرم در میلی لیتر تهیه گردید. همچنین مقدار ۵۰ میلی‌ لیتر آب مقطر، به مدت ۳۰ و۵۰ ثانیه درون مایکروویو (به منظور استفاده در شاهد) قرار داده شد. در این روش از مایکروویو مدل ۲۳۵۰ Samsung MW با فرکانس امواجی معادل ۲۴۵۰ مگاهرتز استفاده گردید (‌شکل ۱۴).
شکل ۱۴: دستگاه استفاده شده در استخراج عصاره با کمک امواج مایکروویو (اصلی-Original)
۳-۶- تهیه عصاره ‌های گیاهی به روش عصاره‌گیری با امواج فراصوت
جهت انجام این مرحله، از اتانول ۹۶ درصد به عنوان واسطه پراکندگی استفاده شد. بدین منظور، ۷۰ گرم از هرکدام از مراحل گیاهی که کاملا پودر شده بودند، درون بشری به حجم ۵۰۰ میلی ‌لیتر ریخته و با اضافه کردن اتانول حجم مخلوط به ۱۵۰ میلی ‌لیتر رسید. سپس بشر حاوی مخلوط ماده گیاهی و حلال، ‌درون دستگاه اولتراسونیک قرار گرفت. عصاره‌گیری باید به مدت ۳۰ دقیقه تحت امواج فراصوت (به موج ‌های صوتی که فرکانس نوسان آن ها بیش از محدوده شنوایی انسان یا ۲۰‏ سیکل^[۳۳] در ثانیه ‎‏باشد، فراصوت گفته می‌شود) انجام می گرفت؛ به دلیل احتمال آسیب‌ دیدن میله^[۳۴] دستگاه اولتراسونیک، بعد از هر ۲ دقیقه امواج دهی، یک دقیقه به دستگاه استراحت داده می ‌شد. بنابراین برای آماده سازی هر عصاره، ۴۵ دقیقه زمان لازم بود. پس از این مدت زمان، ‌بلافاصله عصاره‌ گیاهی توسط کاغذ صافی Whatman N° ۹۱ از باقی مانده‌گیاهی جدا شد. در مراحل بعدی از هر عصاره، غلظت ۵۰ میکروگرم در میلی لیتر تهیه گردیده و در آزمایشات مورد استفاده قرار گرفت. همچنین دامنه نوسان^[۳۵] و سیکل دستگاه التراسونیک در این آزمایش، به ترتیب روی ۸۰ و ۶/۰ تنظیم شد. شدت موج متناسب با مربع دامنه نوسان در آن نقطه است. ارتعاش منبع، ذرات مجاور را به نوسان در می ­آورد و این ذرات نیز ذرات مجاور خود را مرتعش می ­سازند و ارتعاش ماده زنجیروار ادامه یافته و پیش می ­رود. انتقال این ارتعاشات از ذره­ای به ذره دیگر در واقع همان موج صوتی است که در محیط منتشر می ­شود.
جهت عصاره‌گیری به روش استفاده از امواج فراصوت، از دستگاه Ultrasound Technology، مدل UP200s، ساخت شرکت hielscher آلمان استفاده گردید (شکل ۱۵).
شکل ۱۵: دستگاه استفاده شده در استخراج عصاره با کمک امواج فراصوت (اصلی-Original)