مزایای نشانگر SRAP:
سهولت و آسانی
تکرار­پذیری (قابلیت تکثیر) بالا
سرعت عملکرد مناسب
جداسازی آسان باند­ها برای تعیین توالی

شناسایی و تکثیر نواحی هدف( نواحی ORFs)
داشتن پلی­مورفیسم بالا
معایب نشانگر SRAP:
هم­بارز نبودن

۱-۱۳ کاربرد مارکر­های DNA :

۱-توالی­یابی ژنوم: شاید مهمترین کاربرد مارکر­ها باشد. از آنجا که ژنوم یوکاریوت­ها خیلی بزرگ است برای توالی­یابی آن باید ژنوم را به قطعات خیلی کوچک تقسیم کرد و هر قطعه را جداگانه توالی­یابی نمود. لذا باید روی DNA نقاط معیاری وجود داشته باشد تا بتوان بر­اساس آنها نتایج حاصل از توالی­یابی قطعات را کنار هم چید. این معیار­ها می­توانند همان مارکر­ها باشند.
۲- Gene tagging: عبارتست از یافتن پیوستگی بین صفت مورد­نظر با یک مارکر، این امر با بررسی تفرق همزمان(Cosegregation) صفت و مارکر تحقق می­یابد.
۳- Gene mapping: عبارتست از تعیین محل یک ژن روی کروموزوم.
۴- بررسی روابط خویشاوندی: با بهره گرفتن از پلی­مورفیزم مارکری می­توان افراد مختلف را از هم متمایز ساخت. این مورد بیشتر در مطالعات فیلوژنتیکی و تعیین مبدا تنوع اهمیت دارد.
۵- تعیین گروه ­های هتروتیک: در تهیه بذر هیبرید تعیین لاین­های اینبرد والدینی اهمیت زیادی دارد. این والدین باید طوری انتخاب شوند که تعداد هتروزیس حداکثر باشد. مقدار هتروزیس به میزان غالبیت در هر لوکوس و فاصله ژنتیکی والدین بستگی دارد. این فاصله ژنتیکی را می­توان از آنالیز کلاستری که با بهره گرفتن از پلی­مورفیزم مارکری در بین لاین­های مختلف به دست می ­آید، تعیین کرد و بهترین اینبرد­ها را انتخاب نمود.
۷-انتخاب به کمک مارکر (^[۲۶]MAS):مهم­ترین کاربرد مارکر­ها در اصلاح نباتات است. هدف این است که بتوان صفت مورد نظر را با واسطه مارکر پیوسته با صفت، انتخاب کرد. این مساله بسیار مهم است چرا که اگر پیوستگی یک مارکر با ژن مورد­نظر تایید شود آنگاه می­توان در هر مرحله­ ای از رشد گیاه و در هر محیطی اقدام به گزینش نمود. اغلب صفات مهم زراعی مثل عملکرد،
مقابله با خشکی و شوری و … صفاتی کمی هستند که توسط لوکوس­های کمی (QTL^[27]) کنترل می­شوند. لذا امروزه در پروژه­ های اصلاحی سعی بر نقشه­یابی QTLها است تا بتوان از آنها در MAS استفاده کرد.
۷-حفظ ذخایر ژنتیکی: به کمک مارکر­ها می­توان تنوع ژنتیکی موجود را بررسی کرد و در حفظ و سازماندهی آن اقدام نمود(۱۲).

۱-۱۴ واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR)

این تکنیک در اواسط دهه ۱۹۸۰ بوسیله کری مولیس و همکاران معرفی شد (۶۲). روشی است برای همانندسازی گزینشی و مکرر توالی­های مشخصی از DNA. راهکاری است برای تولید نسخه­های بی­شمار از یک توالی ویژه DNA، بدون اینکه به عملیات وقت­گیر کلون کردن نیازی داشته باشد. PCR از نظر اصول عملی تشابه زیادی به همانند سازی DNA دارد. برای انجام PCR هر ناحیه از هر مولکول DNA به شرطی که توالی­های دوطرفه آن شناخته شده باشد قابل انتخاب است بدین دلیل که بایستی دو الیگو­نوکلئوتید کوتاه با مولکول DNA هیبرید گردند یعنی هر کدام به یکی از رشته­ های مارپیچ دوتایی DNA متصل شود. این الیگو­نوکلئوتید­ها که به عنوان آغازگر^[۲۸] برای سنتز DNA بکار می­روند ناحیه­ای را که بایستی تکثیر شود محدود می­نمایند تا کپی شدن الگوی DNA توسط آنزیم پلی­مراز امکان­ پذیر شود. برای تسهیل در اتصال آغازگر به DNA الگو، لازم است که اول رشته­ های DNA توسط حرارت از هم باز شوند، سپس دمای واکنش کاهش داده می­ شود تا جفت­شدن آغازگر با توالی مورد­نظر صورت پذیرد. در نهایت واکنش پلی­مریزاسیون توسط آنزیم DNA پلی­مراز برای تولید رشته مکمل انجام می­ شود.

۱-۱۴-۱ مراحل واکنش زنجیره­ای پلیمراز

۱- مرحله شروع^[۲۹]: به مدت ۱ تا ۹ دقیقه دمای محلول به ۹۴ تا ۹۶ درجه سانتیگراد رسانده می­ شود (در صورتی که پلیمراز­ها به حرارت بالا مقاوم باشند دما تا ۹۸ درجه سانتیگراد نیز می­رسد). این مرحله فقط برای DNA پلیمراز­هایی ضروری است که نیازمند فعال شدن توسط حرارت هستند.
۲- مرحله واسرشت^[۳۰]: این مرحله شامل تجزیه DNA از حالت دو رشته­ای به حالت تک­رشته­ای است. در واقع اولین قسمت از سیکل­های حرارتی منظم است و شامل حرارت دادن محلول به مدت ۲۰ تا ۳۰ ثانیه در دمای ۹۴ تا ۹۸ درجه می­باشد. در این مرحله به­علت گسستن پیوند­های هیدروژنی بین نوکلئوتید­ها، DNA الگو و آغازگر­ها از هم جدا می­شوند و تک­رشته­ های DNA حاصل می­گردند.
۳- مرحله اتصال^[۳۱]: این مرحله بسیار مهم است. دمای بهینه اتصال بستگی به نوع آغازگر­های مورد­استفاده دارد. دمای محلول به مدت ۲۰ تا ۴۰ ثانیه به ۵۰ تا ۶۵ درجه کاهش می­یابد. در این مرحله آغازگر­ها به تک­رشته­ های DNA الگو متصل می­شوند. پیوند­های هیدروژنی پایدار تنها زمانی شکل می­گیرد که توالی آغازگر و رشته الگو مکمل یکدیگر باشند. آنزیم پلی­مراز پس از اتصال به هیبرید آغازگر- الگو، همانندسازی DNA را آغاز می­ کند (۶۹).
۴- مرحله طویل شدن^[۳۲]: این مرحله شامل بسط دادن دنباله آغازگر توسط آنزیم DNA پلی­مراز است. دمای محلول در این مرحله باید متناسب با نوع DNA پلیمراز مورد­استفاده باشد. برای انجام این مرحله از یک DNA پلیمراز ویژه به نام تک DNA پلی­مراز^[۳۳] استفاده می­ شود. دمای اپتیمم برای این آنزیم حدود ۷۵ الی ۸۰ درجه است. در این مرحله آنزیم DNA پلی­مراز با بهره گرفتن از dNTP­های موجود در محلول، یک رشته DNA جدید را در جهت ‘۵ به ‘۳ و در مقابل رشته­ های الگو می­سازد. مدت زمان این مرحله نیز باید متناسب با نوع DNA پلی­مراز و طول رشته DNA باشد. در دمای بهینه، DNA پلی­مراز در هر دقیقه، یک هزار باز را پلیمریزه می­نماید. در مرحله طویل شدن در صورت وجود سوبسترای کافی و تأمین شرایط بهینه، مقدار DNA در محلول PCR دو برابر می­ شود. بنابر این در هر چرخه PCR، غلظت DNA بصورت تصاعدی افزایش می­یابد (روش PCR آنچنان سریع عمل می­ کند که پس از گذشت ۲۰ چرخه از آن، ۱۰۴۸۵۷۶ نسخه از توالی مورد­نظر تولید خواهد شد). تعداد چرخه­ها معمولاً بین ۲۵ تا ۴۵ چرخه است و با افزایش این تعداد، افزایش محصولات غیر­اختصاصی دیده می­ شود. زمان هر چرخه بستگی به زمان لازم برای گرم شدن و خنک شدن بین چرخه­ها دارد.
۵- مرحله طویل شدن نهایی^[۳۴]: این مرحله، پس از آخرین چرخه PCR، به مدت ۵ الی ۱۵ دقیقه در دمای ۷۰ الی ۷۴ درجه انجام می­ شود تا اطمینان حاصل شود که همه تک­رشته­ های DNA همانندسازی شده ­اند .
نگهداری نهایی^[۳۵]: در این مرحله، محلول نهایی به مدت کوتاهی در دمای ۴ الی ۱۵ درجه قابل نگهداری است.

شکل ۱-۵ واکنش زنجیره ای پلی­مراز

۱-۱۵ تجزیه و تحلیل داده ­ها

۱-۱۵-۱ دندروگرام :

دندروگرام از دو واژه یونانی Dendron ، به معنی درخت و gramma به معنی کشیدن گرفته شده است و شامل یک نمودار درختی است که اغلب برای شرح و توضیح آرایش و نظم و ترتیب خوشه ­ها به کار می­رودو به وسیله یک خوشه­بندی مرتبه­ای به وجود آمده است. دندروگرام اغلب در محاسبات بیولوژی برای شرح خوشه­بندی اقلام بکار می­رود. دندروگرام یک اصطلاح گسترده برای نمایش یک درخت تکامل نژادی است. آنالیز خوشه­ای شامل چندین تکنیک متوالی است که برای تشخیص گروه­هائی از جنس­های مشابه درون یک گروه خاص کاربرد دارد. در واقع آنالیز خوشه­ای، اطلاعات کلی ما را در چندین گروه مجزا تقسیم می­ کند . روش خوشه­بندی مرتبه­ای توان رده­بندی انواع متفاوتی از اقلام را از اقلام بسیار مشابه با یکدیگر تا خوشه­های بزرگی که شامل اقلام بسیار ناهمسان هستند را داراست. این روش تجزیه و تحلیلی معمولا یک محصول گرافیکی تولید می­ کند که دندروگرام یا درخت­واره نامیده می­ شود که در واقع همان ساختار خوشه­ای مرتبه­بندی شده را نشان می­دهد. بعضی از این روش­های رده­بندی ،تقسیم کننده هستند که یک خوشه بزرگ را که در برگیرنده همه اطلاعات می­باشد را در داخل گروه ­های کوچک­تر تقسیم می­ کنند و این فرایند را تا آنجا تکرار می­ کنند تا اینکه تمام خوشه ­ها تقسیم شود. دیگر روش­های رده­بندی دارای خاصیت تراکم­سازی هستند و برمبنای پیدا کردن اقلام مشابه استوارند بدین طریق که ابتدا مشابه­ترین جنس در یک خوشه قرار می­گیرد و سپس اقلام مشابه­تر به آن خوشه افزوده می­ شود تا اینکه تمامی اقلام در یک خوشه بزرگ مجزا گنجانیده شوند (۳۱). روش­های رده­بندی دارای خاصیت متراکم­سازی در علوم طبیعی بیش­تر متداول­اند. نتایج حاصل از تجزیه و تحلیل خوشه­ای توسط دندروگرام مشخص می­ کند که اقلام اولیه در چه سطحی از شباهت درون خوشه­های مجزا قرار گرفته­اند . محور x میزان شباهت­ها و فاصله­ها را نشان می­دهد، خوشه ­ها ممکن است ۲ به۲ (جفت جفت) به همدیگر متصل شوند و متناوباً شاخه­ های بعدی به خوشه موجود افزوده شوند این گونه پیوستن متوالی از نمونه­های انحصاری ، به صورت زنجیره­ای صورت می­گیرد که البته مشکل اساسی این روش اثر زنجیره­ای می­باشد که تفسیر و تشخیص گروه ­های حاصل را مشکل می­سازد. تعیین تعداد گروه ­های اصلی در آنالیز خوشه­ای اغلب هدف عمده ما محسوب می­ شود . به طور کلی یک روش برای گروه­بندی داده ­ها تعریف می­ شود که بر اساس طول شاخه­هاست ، گاهی اوقات گروه­بندی شاخه­ها بر اساس سطح ثابتی از تشابه تعریف می­ شود به طوریکه یک خط در یک سطح انتخاب شده از تشابه ترسیم می­ شود و تمام شاخه­هائی که این خط را قطع کرده ­اند ، نشان دهنده یک گروه مجزا می­باشند(۳۲).

۱-۱۵-۲ تجزیه خوشه­ای:

تجزیه خوشه­ای روشی مناسب برای گروه­بندی افراد می باشد، به طوری که اولاً افراد هر گروه با در نظر گرفتن خصوصیات ویژه­ای، مشابه باشد و ثانیاً هر گروه بایستی از لحاظ همان خصوصیات مشخص با گروه دیگر تفاوت داشته باشد. با این مفهوم که مشاهدات درون یک گروه با مشاهدات گروه دیگر تفاوت داشته باشد. مفهوم واژه تشابه به اهداف تحقیق بستگی دارد و در هر تجزیه بایستی تعریف شود.

۱-۱۵-۳ ضریب شباهت:

اولین مرحله در تجزیه کلاستر، انتخاب نوع معیار فاصله یا شباهت ژنتیکی است. فاصله یا شباهت ژنتیکی بین ژنوتیپ­ها یا جمعیت­ها میتواند بسته به نوع صفات مورد مطالعه و داده ­های حاصله، با بهره گرفتن از روش­های مختلف برآورد شود. در مورد داده ­های حاصل از صفات کمی فاصله اقلیدسی از متداولترین معیارهای برآورد فاصله ژنتیکی است. برای صفات کیفی یا داده ­های نشانگر که به صورت یک و صفر بیان می گردند، ضرایب متعددی برای برآورد فاصله یا شباهت ژنتیکی استفاده می­شوند که مهم­ترین آنها عبارتند­از: ضریب شباهت جاکارد، ضریب نی و لی، ضریب تطابق ساده (۵۸).

۱-۱۵-۴ انتخاب الگوریتم:

مرحله دوم انتخاب نوع الگوریتم جهت کلاستر بندی است. الگوریتم­های متعددی برای تجزیه کلاستر پیشنــهاد شده ­اند. این الگوریتم­ها به دو گروه اصلی تقسیم می­شوند: ۱-روش­های مبتنی بر فاصله که فاصله یا شبـاهت دو به دو افراد یا ژنوتیـپ­ها جهت گروه­بندی محاسبه می­شود۲- روش­های مبتنی بر مدل که فرض بر این است که افراد درون هر کلاستر، مشاهدات تصادفی از برخی مدل­های پارامتری بوده و استنباطات آماری مربوط به پارامترهای هر کلاستر و تعیین عضویت در هر کلاستر با بهره گرفتن از روش­های آماری استاندارد مانند حداکثر درشت نمایی و … انجام می­گیرد. در مطالعات ژنتیکی بیشتر از روش­های مبتنی بر فاصله، به خصوص روش اتصال میانگین (UPGMA) استفاده می­ شود، که البته مشکل اساسی این روش اثر زنجیره­ای است که تفسیر و تشخیص گروه ­های حاصل را مشکل می­سازد (۵۸).

۱-۱۶ بررسی کارآیی الگوریتم مورد استفاده در تجزیه کلاستر:

معیارهای متفاوتی برای بررسی کارآیی الگوریتم­های مختلف کلاستر استفاده می­شوند که از متداول ترین آنها می­توان به ضریب همبستــگی کوفنـتیک اشاره کرد. این ضریـب، همبستگی بین ورودی) ماتریس شباهت و یا فاصله (و خــروجی (ماتریس کوفنتیک که از دندوگرام بدست می آید(، تجزیه کلاستر را نشان می­دهد، که مقدار آن بین ۰ الی۱ می­باشد. اگر این ضریب بزرگتر یا مساوی ۹/۰ باشد، نشان­دهنده کارآیی الگوریتم در گروه­بندی است . با این وجود در مورد داده ­های مولکولی ضریب پایین به مفهوم عدم کارآیی آن الگوریتم نیست بلکه نشان­دهنده اختلال در داده ­ها به علت وجود داده ­های گم­شده است. اگر۹/۰ r >باشد برازش بسیار خوب است. اگر ۹/۰< < r 8/0باشد برازش خوب است. اگر ۸ /۰< < r 7/0 باشد برازش ضعیف است. اگر r کمتر از ۷/۰ باشد برازش بسیار ضعیف است (۴۹).
۱-۱۷ شاخص شانون
یک اندازه‌گیری که بوم‌شناسان برای بررسی فراوانی درجمعیت به کار می‌برند شاخص شانون-واینر یا اطلاعات است. این شاخص یک فرمول ریاضی است که از نظریه‌ی اطلاعات گرفته شده است که به وسیله‌ی مهندسان برای تحیلی بازدهی انتقال داده در خط‌های تلفن توسعه یافته است. این شاخص، H، با فرمول زیر به دست می‌آید:
H=-Sigma Pi ln Pi
هر چند که پیچیده به نظر می‌رسد، معنی آن این است که برای هر گونه نسبت (p) آن به کل را تعیین میکنید و سپس آن شماره را در لوگاریتم طبیعی آن عدد (ln) و خود آن عدد ضرب می کنیم. تا اینجا p ln p به دست می‌آید. این کار را برای هر گونه در اجتماع انجام می‌دهیم و سپس همه‌ی شماره‌های به دست آمده را جمع می‌کنیم. از آنجا که این شماره منفی خواهد شد، برای آسانی کار آن را مثبت می‌کنیم. هر چقدر این پارامتر بیشتر باشد نشان دهنده فاصله و تمایز بیشتر در بین جمعیت­هاست(۲۸).
۱-۱۸ بررسی تنوع و تفاوت ژنتیکی بین جمعیت­ها براساس آنالیز Nei
جهت کمی نمودن تمایز درون و بین جمعیت­ها از آنالیز Nei استفاده می­ شود که از سه ضریب متفاوت تشکیل شده است:
تنوع ژنتیکی کل جمعیت­ها H_T
تنوع ژنتیکی درون جمعیت H_S
تنوع ژنتیکی بین جمعیتی G_ST
این سه برآورد به صورت زیر به هم مرتبط هستند: