۳-۱۶-۱-تهیه‌ی ژل آگاروز جهت انجام الکتروفورز ژنوم اسنخراج شده و محصول PCR
جهت الکتروفورز ژنوم استخراج شده به دلیل طویل بودن قطعه ژنی، ژل آگاروز ۱% تهیه گردید و برای الکتروفورز محصول PCR ژل آگاروز ۵/۱% استفاده شد،لذا برای درست کردن ژل آگاروز ۵/۱% به حجم۱۰۰ میلی لیتر، مقدار ۵/۱ گرم از پودر آگاروز را با ترازو وزن کرده و با بافر ۱x TBE آن را به حجم ۱۰۰ میلی لیتر رسانده و برای تهیه ژل آگاروز ۱%، ۱ گرم از پودر آگاروز استفاده شد ،بعد آن را سه بار روی شعله قرار داده تا کاملا شفاف شود ولی نجوشد سپس به آن ۵/۲ میکرولیتر Safe stain جهت رنگ آمیزی ژل اضافه شد. پس از کمی سرد شدن آن را داخل کاست الکتروفورز ریخته و شانه ها را داخل آن قرار داده و صبر کرده تا ژل کاملا سرد شود. به این ترتیب با بیرون آوردن شانه، چاهک های مورد نظر ایجاد خواهد شد. هنگامی که رنگ از دو سوم ژل عبور کرد، جریان برق قطع گردید و ژل از داخل تانک بیرون آورده شد و در مرحله بعد در دستگاه ژل- داکیومنشن مورد بررسی قرار گرفته و عکس مربوطه در کامپیوتر ذخیره گردید.

۳-۱۷-تعیین توالی:
محصول PCR خالص سازی شد و توسط کمپانی MWG با روش سانگر تعیین توالی شدند.
فصل چهارم
نتایج و بحث
۴-۱-نتایج مربوط به جداسازی گونه های انتروکوکی از نمونه های بالینی
در این پژوهش ۱۵۰ نمونه باکتری انتروکوک (انتروکوکوس فکالیس و انتروکوکوس فاسیوم) از نمونه های بالینی، در سه بیمارستان بقیه ا..(عج).، میلاد و امام خمینی مورد جمع آوری گردید. از ۱۵۰ نمونه ی بالینی که با انجام تست های بایل اسکولین آگار و رشد در۵/۶% aClN و تخمیر قند آرابینوز متعلق بودن آن ها به جنس انتروکوک مشخص شد ۸۷ نمونه (۵۸%) آرابینوز را تخمیر نکردند که انتروکوکوس فکالیس بودند و بقیه نمونه ها که آرابینوز را تخمیرکردند انتروکوکوس فاسیوم تعلق داشتند. سویه های جمع آوری شده از نمونه های ادرار، زخم، خون، واژینال، بال و تراشه جداسازی شدند که درصد فراوانی آن ها به شرح نمودار (۴-۱) می باشد
نمودار(۴-۱) درصد فراوانی انتروکوک های جداسازی شده از نمونه های بالینی
۴-۲-نتایج حاصل از کشت انتروکوک ها بر روی محیط و رنگ آمیزی گرم
با کشت بر روی محیط بلاد آگار، کلنی های سفید رنگ بزرگ، حالت موکوئیدی و فرورفته دیده شد که دارای همولیز گاما( فاقد لیز گلبول قرمز هستند).
شکل(۴-۱) کشت روی محیط بلاد آگار
با کشت بر روی محیط BHI Broth Nacl %6.5، با ایجاد کدورت و رشد باکتری درمحیط مشخص شد انتروکوک ها قادر به تحمل غلظت بالای نمک کلریدسدیم در محیط هستند.
شکل( ۴-۲) کشت در محیط۵/۶ BHI Broth Nacl % الف) لوله ی سمت چپ لوله ی تلقیح نشده با باکتری ب) لوله ی سمت سمت راست کدورت نشانه ی رشد باکتری در محیط
با رنگ آمیزی گرم انتروکوک ها و مشاهده توسط میکروسکوپ الکترونی ،کوکسی های گرم مثبت ( به رنگ بنفش) دیده شدند.
شکل(۴-۳ )رنگ آمیزی گرم انتروکوک و مشاهده توسط میکروسکوپ با بزرگنمایی ۱۰۰X
که به صورت کوکسی های گرم مثبت مشاهده شدند
بعد از تشخیص جنس انتروکوک ها، به تفکیک جداسازی گونه ی انتروکوکوس فکالیس و انتروکوکوس فاسیوم از دیگر گونه های انتروکوک پرداختیم. با بهره گرفتن از محیط لاکتوز و رشد این دو گونه انتروکوک و ایجاد تغییر رنگ محیط از قرمز به زرد لیمویی به مثبت بودن آن پی بردیم.
شکل(۴-۴) محیط کشت لاکتوز الف)لوله سمت راست عدم رشد باکتری و منفی ب) لوله سمت چپ رشد باکتری در محیط لاکتوز و مثبت
برای جداسازی گونه ی انتروکوکوس فاسیوم از انتروکوکوس فکالیس از محیط کشت پایه قندی آرابینوز استفاده شد که با رشد باکتری در محیط و ایجاد تغییر رنگ محیط از قرمز به زرد نشان دهنده ی رشد باکتری و گونه انتروکوکوس فاسیوم است.
شکل(۴-۵) محیط کشت آرابینوز جهت افتراق دو گونه انتروکوکوس فاسیوم و انتروکوکوس فکالیس، رشد باکتری نشان دهنده انتروکوکوس فاسیوم
شکل(۴-۶) محیط کشت آرابینوز عدم رشد باکتری انتروکوکوس فکالیس
جدول( ۴-۱) درصد فروانی انتروکوکوس فکالیس و انتروکوکوس فاسیوم در نمونه های بالینی