هیبریداسیون و اتصال آغازگرها^[۷۰]: در این مرحله دما را پایین می­آورند(معمولاً تا C^◦۶۵-۴۵)،تا آغازگرها بتوانند به رشته­ های DNA متصل شوند.
طویل­سازی(بسط یا سنتز)^[۷۱]: در این مرحله حرارت را بالا می­برند(معمولاً تا C^◦۷۴-۷۲) تا آنزیم پلیمراز،کار همانندسازی را انجام دهد.
از یک DNA دورشته­ای دو DNA دو رشته­ای ساخته می­ شود و سپس مراحل تکرار شده و تکثیر DNA ادامه می­یابد تا جایی که واکنشگر­ها به اتمام برسد[۲۹].
-در ابتدای طراحی واکنش PCR،از آآنزیم DNAپلیمرازِ باکتری Ecoli استفاده شد. امّا این آنزیم به حرارت و افزایش دما حساس است و پس از هر بار حرارت دادن،لازم بود به محیط واکنش اضافه شود. امّا این مشکل با کشف باکتری­ های گرمادوست^[۷۲]که دارای DNAپلیمراز مقاوم به گرما بودند،حل شد.
آنزیم Taqپلیمراز مربوط به باکتری Thermos aquaticus می­باشد که دمای بهینه عمل آن c^◦۷۲ است و حداکثر دمای کارکرد این آنزیم c^◦۹۴ است. مزیت دیگری که این آنزیم دارد،افزایش دقّت واکنش PCR است. چون از اتصال آغازگرهای غیر اختصاصی که معمولاً در دمای پایین رخ می­دهد جلوگیری می­ کند[۲۹].
-برای بررسی نتیجه PCR به راحتی می­توان از ژل آگارز و عمل الکتروفورز بهره برد[۲۹].

۱-۵- PCR کمّی^[۷۳]
۱-۵-۱- تعریف
تکنیک Real-Time PCRدر واقع همان PCR است با این تفاوت که در آن میزان محصولات تولیدی در هر چرخه،بدون نیاز به دستکاری­های بعدی،اندازه ­گیری می­ شود. به طور کلی این تکنیک برای مشاهده بی­وقفه ی پیشرفت واکنشPCRدر طول زمان می­باشد. همچنین با این روش می­توان مقادیر تولیداتPCR(DNA,cDNA) را نیز اندازه گیری نمود[۲۶، ۱۴، ۴].
۱-۵-۲- مزایا
این روش بر مبنای فلوروسنت  تولیدی از مولکول گزارشگر^[۷۴]می­باشد که در طول واکنش افزایش می یابدو مزایایی نسبت به PCR معمولی دارد :
قابل مشاهده تکثیر در هر زمان.
امکان بهینه­سازی واکنش. به گونه ­ای که مناسب­ترین غلظت DNA،پرایمر و همچنین تعداد سیکل لازم برای تکثیر مشخص می­ شود.
امکان قطع واکنش در زمان دلخواه.
آنالیزPCR کمی با بهره گرفتن از روش سنجش مطلق و سنجش نسبی و اندازه ­گیری میزان دقیق و نسبی الگوی اولیه.
سرعت بالای واکنش و لزوم زمان کمتر.
بالاتر بودن محدوده تشخیص از PCR معمولی[۲۶، ۱۴،۴].
۱-۵-۳- مراحل اصلی
مراحل اصلی این واکنش،همان مراحل PCR معمولی است :
باز شدن دو رشته DNA از هم(واسرشت­سازی)
اتصال آغازگرها(هیبریداسیون)
سنتز مولکول جدید(طویل شدن)[۱۴, ۴].
۱-۵-۴- روش­های انجام این تکنیک

تشخیص غیر اختصاصی^[۷۵] با بهره گرفتن از رنگ های متصل شونده بهDNAیا رنگ­های اینترکاله^[۷۶]
در اینروش از رنگ­های متصل­شونده به DNA به عنوان گزارشگر فلوروسنت برای مشاهده واکنش  PCRاستفاده می­ شود. این فلوروسنت در سیکل متوالی بر اثر مضاعف شدن افزایش می­یابد. با ثبت مقدار فلوروسنت ساطع شده در سیکل،می­توان واکنش را در طول مرحله نمایی مشاهده نمود. از جمله رنگ­ها به عنوان گزارشگر که مورد استفاده در این روش هستند،می­توان بهSYBR Greenاشاره کرد. نحوه عملکرد این رنگ به این صورت است که به شکاف کوچک^[۷۷] مارپیچ دو رشته­ای DNA^[78]باند می­ شود و با جذب طول موج nm498،نور nm522ساطع می­کندکه توسط دستگاه ثبت می­ شود.SYBR Green،تحت شرایط PCR،پایدار باقی می­ماند. سطح مطلوبی از درجه حرارت موجب تنظیم القاء و نشر طول موج ها می شود. در داخل محلول, رنگ­هایی که به DNAباند نشده­اند،فلوروسنت خیلی کمی را نشان می­ دهند و فلوروسنت  زمانی به وضوح  افزایش می بابد که رنگ به DNA دو رشته­ای متصل شود. در ضمن این رنگ به الگوهای تک­رشته­ای متصل نمی­ شود لذا در این موارد نیز بازتاب کمی دارند[۲۶، ۱۴،۴].

شکل( ۱-۱۴) : مکانیسم عمل رنگ SYBR-Green طی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز(PCR).
در ابتدا در فاز Denaturation تمامی اجزا از هم جدا هستند و زمانی که مولکول DNA تک‌رشته‌ای است رنگ SG به آن اتصال نمی‌یابد،از این رو سیگنالی مشاهده نمی‌شود. اما در فاز Annealing در اثر اتصال آغازگر­ها به تدریج رنگ شروع به اتصال می­ کند. با شروع فاز Extention، وقتی که مولکول DNA وارد واکنش PCR شده و همانندسازی انجام می‌شود (DNA دو‌رشته‌ای)،اتصال رنگ SG به DNA شدّت یافته و در انتهای این فاز به اوج خود می­رسد. بنابر­این در انتهای هر سیکل به دلیل دو برابر شدن محصولات شدت سیگنال بالا می­رود.
رنگ اینترکالهSYBR Green،واجد ۲ مزیّت عمده است که آن را به متداول­ترین رنگ مورد استفاده تبدیل کرده­است :
استفاده از این رنگ­،بسیار کم­هزینه است چون دیگر نیازی به طراحی شناساگر^[۷۹]اختصاصی و آغازگرهای جدید نیست و طراحی آزمایش به سهولت انجام می­گیرد.
این رنگ،یک رنگ غیر اختصاصی است لذا برای تمامی آزمایشات قابل استفاده است.
این مسئله در واقع مهم­ترین عیب این رنگ نیز به­شمار می ­آید. چرا که این رنگ به همه مولکول­های دو رشته­ای از جنسDNA متصّل می­ شود. این مولکول­ها می­توانند محصولات غیر اختصاصی^[۸۰] و آغازگر­های جفت­شده^[۸۱] نیز باشند. بنابر­این سیگنال­های فرستاده­شده در دستگاه هم سیگنال هدف­ و هم سیگنال فرعی می­باشند.در نتیجه در این روش،تمایز و تفاوت بین سیگنال هدف­ و سیگنال فرعی،ضروری است. البته استفاده از منحنی خاصّی به نام منحنی ذوب که در ادامه به آن اشاره خواهد شد،این مشکل را تا حدّی مرتفع کرده­است[].
۱-۵-۴-۲- تشخیص اختصاصی^[۸۲] با بهره گرفتن از شناساگرهای هدف
اساس این روش از تعدادی شناساگرهای الیگونوکلئوتیدی است و در آن از رنگ فلوروسنت گزارشگر به همراه رنگ خاموشگر^[۸۳] استفاده می شود. شناساگرهای مورد استفاده،انواع مختلفی دارند که در زیر به برخی از آن­ها اشاره شده­است :

شناساگرهای دوسویه نشاندار یا شناساگرهایTaqMan^[84]
شناساگرهای دو‌سویه نشاندار،الیگونوکلئوتیدهای کوتاهی^[۸۵] هستند که در انتهای ۵’ آن‌ها یک رنگ گزارشگر فلورسنس و در انتهای ۳’ یک مولکول خاموشگر متصل می‌باشد. به علت کوتاه بودن طول شناساگر(حدود ۲۵-۱۵ نوکلئوتید)، رنگ گزارشگر و مولکول خاموشگر تقریباً در کنار یکدیگر قرار می‌گیرند. این امر منجر به کم شدن سیگنال فلورسانس است. در طول پروسه،آنزیم Taq-DNA پلیمراز از محل آغازگرها، همانند‌سازی را آغاز می‌کند.این آنزیم علاوه بر فعالیت پلیمریزاسیون در جهت ۵’ به ۳’، دارای فعالیت اگزونوکلئازی در جهت’۵ به۳’ نیز است. آنزیم با عمل اگزونوکلئازی خود منجر به برششناساگر در ناحیه پایین‌دست^[۸۶] در زمان همانندسازی می‌شود. هنگامی که شناساگر شکسته شود، رنگ گزارشگر از مولکول خاموشگر جدا می‌شود. در هر سیکل تکثیر به علت شکسته شدن مولکولشناساگر، میزان رنگ گزارشگر افزایش می یابد. سپس سیگنال حاصل توسط دستگاه Real-Time PCR شناسایی و آنالیز می‌شود. به علت جداشدن رنگ گزارشگر، آنالیز منحنی ذوب^[۸۷] در این روش امکان‌پذیر نمی‌باشد. شناساگر دوسویه نشاندار دارای اختصاصیت بیشتری نسبت به رنگ‌های اینترکاله هستند. اثبات این مطلب با دو دلیل میسر می‌شود.
۱.شناساگرهای دوسویه نشاندار توالی‌های ویژه و اختصاصی هستند که تنها به ناحیه مکمل خود متصل می‌شود.
۲.شناساگرهای دوسویه نشاندار برای هر کپی (نسخه) تکثیر شده تنها یک مولکول رنگ فلورسنتی آزاد می‌کنند. از این رو به علت اختصاصیت بالای شناساگر‌های دوسویه نشاندار،این نوع روش آشکارسازی در مواقع پایین بودن تعداد نسخه‌های الگو بسیار مناسب و کارآمد می‌باشد[۲۶،۱۴،۴].

شکل( ۱-۱۵) : مکانیسم عمل شناساگرهای دوسویه نشاندار یا شناساگرهای TaqMan طی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز(PCR).
میزانافزایشفلوروسنس گزارشگر بامیزانمحصولتولیدشدهدرارتباطمی­باشد. درهرسیکلباآزادشدنبیشتر Reporter ،مادهفلوروسنسبیشتریساطعمی­شودوتوسطدستگاهثبتمی­گردد.