۳-۱۳- همسانه‌سازی قطعه مورد نظر در پلاسمید
برای همسانه‌سازی[۲۲] محصول پی‌سی‌آر تکثیر شده با آغازگرهای PMH1RTPF و PMH1RTPR از کیت InsTACloneTM PCR Product cloning شرکت Fermentase استفاده شد.
۳-۱۳-۱- اتصال قطعه مورد نظر به درون ناقل پلاسمیدی
جهت الحاق محصول پی‌سی‌آر در ناقل pTZ57R/T (شکل ۳-۳) مواد لازم به مقادیر ذکر شده در جدول (۳-۱۱) در یک میکروتیوب ml5/0 ریخته و به خوبی با هم مخلوط شدند سپس میکروتیوب برای مدت یک شب در دمای C° ۲۲ قرار داده شد.
شکل ۳-۳- ناقل پلاسمیدی pTZ57R/T.
جدول ۳-۱۱- نوع و مقدار مواد مورد استفاده در واکنش اتصال.
| میزان مصرف | اجزای واکنش اتصال |
| ۵/۱ میکرولیتر | pTZ57R/T ناقل پلاسمیدی |
| ۳ میکرولیتر | محصول واکنش زنجیره‌ای پلیمراز |
| ۳ میکرولیتر | بافر اتصال ( X۵) |
| ۵/۰ میکرولیتر | آنزیم T4 لیگاز u/µl) 5 ( |
| ۷ میکرولیتر | آب مقطر استریل |
| ۱۵ میکرولیتر | حجم کل |
۳-۱۳-۲- انتقال پلاسمید نوترکیب به باکتری E. coli سویه DH5α
طبق دستورالعمل کیت همسانه سازی برای انتقال پلاسمید به باکتری به طریق زیر عمل شد:
۱- به ازای هر نمونه ۱۰۰ میکرولیتر از باکتری کشت داده شد و ۷۵۰ میکرولیتر از محیط کشت C-medium که قبلا به مدت ۲۰ دقیقه در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد نگهداری شده بود با هم مخلوط شد و برای مدت ۳ تا ۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد در یک فالکون روی شیکر قرار داده شد تا مخلوط شوند.
۲- به میزان۱۱۰ میکرولیتر از محلول TA و ۱۱۰ میکرولیتر از محلول TB با هم مخلوط شده و روی یخ قرار داده شد.
۳- به میزان ۸۵۰ میکرولیتر از باکتری و محیط C-medium که روی شیکر قرار داشت به یک تیوب ۵/۱ میکرولیتری منتقل و برای مدت ۱ دقیقه در دور rpm13000 سانتریفیوژ شد.
۴- محلول رویی حذف شده و ۱۵۰ میکرولیتر از محلول (TA+TB) به محلول مرحله ۳ اضافه و به خوبی مخلوط شد تا رنگ آن شیری شد.
۵- تیوب‌ها برای مدت ۵ دقیقه روی یخ قرار داده شدند.
۶- تیوب‌ها برای مدت ۱ دقیقه با دور rpm13000 سانتریفیوژ شدند.
۵- محلول رویی حذف شد و به رسوب ۶۰ میکرولیتر از محلول (TA+TB) اضافه شد و به خوبی مخلوط شد تا رنگ آن شیری شد.
۷- تیوب‌ها برای مدت ۵ دقیقه روی یخ قرار داده شدند.
۸- به میزان ۶ میکرولیتر از محصول اتصال که برای مدت ۲ دقیقه روی یخ قرار داده شده بود به تیوب‌ها اضافه شد.
۹- تیوب‌ها برای مدت ۵ دقیقه روی یخ قرار داده شدند و سپس ۶۶ میکرولیتر از هر تیوب روی محیط جامد حاوی µg/ml 50 آمپی‌سیلین به صورت چمنی کشت داده شد.
۱۰- پتری‌دیش‌ها برای تمام مدت شب در ۳۷ درجه قرار داده شدند.
۳-۱۳-۳- انتخاب همسانه‌ها
برای تایید و اطمینان از انتقال دی‌ان‌ای نوترکیب مورد نظر به باکتری‌ها، از کلنی‌هایی که روی محیط حاوی µg/ml 50 آمپی‌سیلین رشد کرده بودند تک کلنی‌هایی انتخاب و در کلنی پی‌سی‌آر استفاده شدند. جهت انجام کلنی پی‌سی‌آر به هر تیوب، پنج میکرولیتر محیط کشت LB اضافه شد و با سر لوپ از کلنی‌های منتخب، برداشته شد و برای تمام مدت شب در ۳۷ درجه سانتیگراد روی شیکر رشد داده شدند. یک میکرولیتر از محلول رشد کرده به جای دی‌ان‌ا طبق جدول (۳-۱۲) عمل پی‌سی‌آر انجام شد. پس از اتمام واکنش پی‌سی‌آر، محصول پی‌سی‌آر روی ژل آگارز یک درصد الکتروفورز شد.
جدول ۳-۱۲- چرخههای دمایی واکنش کلنی پی‌سی‌آر.
