کلستریدیوم لانگالی
باکتری کلستریدیوم لانگالی برای اولین بار در سال ۱۹۸۹ در دانشگاه آرکانزاس، از محیط کشتی که با فضولات مرغ^[۹۱] در ۵pH= تلقیح شده و در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد تحت اتمسفر گاز سنتزی حاوی CO، H₂، CO₂ و CH₄ (به ترتیب ۷۳، ۱۵، ۱۰ و ۲%) انکوبیت شده بود جداسازی گردید. این ارگانیزم جداسازی شده برای تقدیر از پژوهشها و زحمات لارس لانگال^[۹۲] در مطالعه استوژنها و کلستریدیا به نام کلستریدیوم لانگالی نامیده شد [۴۶]. میکروگراف TEM این باکتری در شکل ۲-۱ نشان داده شده است.

شکل ‏۲‑۱: میکروگراف TEM باکتری کلستریدیوم لانگالی [۴۶]
همه گونه های باکتری لانگالی بی هوازی و گرم مثبت^[۹۳] بوده و حاوی ۲۲% مولی نوکلئوتید گوانین^[۹۴] و سیتوزین^[۹۵] (G+C) هستند [۴۶ ۱۲,]. باکتری توسط تاژک^[۹۶] حرکت می کند و سلولها به ندرت اسپورزایی^[۹۷] می کنند [۸۸]. گونه های مختلف این باکتری می توانند به صورت اتوتروف^[۹۸] با CO یا H₂/CO₂ رشد کرده و یا به صورت کموارگانوتروف^[۹۹] با انواعی از سوبستراها از جمله فرمات، اتانول، پیروات، فرمارات، اریتروز^[۱۰۰]، ترئوز^[۱۰۱]، آرابینوز^[۱۰۲]، زایلوز، گلوکز و فروکتوز رشد کند [۴۶]. تحمل گونه های مختلف این باکتری در برابر CO یکسان نیست، همچنین نرخ مصرف سوبسترای گازی و تولید محصول در آنها متفاوت است. میزان تولید اتانول در گونه های “وحشی^[۱۰۳]” این باکتری که در طبیعت یافت می شوند بسیار کم است. درگونه هایی از باکتری لانگالی که در دمای۳۷ درجه سانتیگراد فعالیت می کنند میزان تولید اتانول به استات (که ممکن است به صورت اسید استیک یا نمک استات باشند) ۱ به ۲۰ در حالت “وحشی” است. میزان اتانول تولیدی عموما ۲-۱ گرم در لیتر است. با وجود آنکه توانایی این باکتری برای تولید اتانول مورد توجه زیادی قرار گرفته است، اما به دلیل کم بودن میزان اتانول تولیدی نمی توان از گونه “وحشی” باکتری برای تولید اتانول در مقیاس تجاری استفاده کرد. با اندکی دستکاری در ترکیب مواد مغذی می توان به بازده تولید ۱ به ۱ اتانول و استات رسید اما میزان اتانول تولیدی کمتر از ۱۰ گرم بر لیتر است که موجب بازده محصول کم (۱۰ گرم در لیتر در روز) می گردد. علاوه بر این، پایداری محیط کشت نیز مساله است که در درجه اول به غلظت بالای اسید استیک (۳-۵/۲ گرم در لیتر) در کنار اتانول مربوط می شود. با افزایش شدت جریان گاز به منظور بهبود تولید اتانول، اثرات بازدارندگی روی محیط کشت ابتدا توسط استات و سپس CO ظاهر می گردد. در نتیجه، محیط کشت ناپایدار شده و توانایی خود را برای مصرف گاز و تولید محصول از دست می دهد [۱۲]. مطالعاتی برای افزایش تولید اتانول توسط این باکتری انجام گرفته است که در ادامه به آنها اشاره می گردد.
مسیر متابولیکی ^[۱۰۴] استوژنها
مسیر متابولیکی وود-لانگال^[۱۰۵] برای اولین بار توسط وود^[۱۰۶] و لانگال^[۱۰۷] برای استوژنها پیشنهاد گردید. این مسیر متابولیکی، تبدیل CO و H₂ به استیل-کوآنزیمA ^[۱۰۸] و محصولاتی نظیر استات را هدایت می کند. از آنجا که در این مسیر، استیل-کوآنزیم A به عنوان یک ترکیب واسطه است و کربن منوکسید دی هیدروژناز به عنوان یک انزیم کلیدی حضور دارند، این مسیر اغلب با عنوان “مسیر استیل-کوآنزیمA ” یا “مسیر کربن منوکسید دی هیدروژناز” نامیده می شود[۷۴] . باکتریهای استوژنیک از مسیر استیل-کوآنزیمA به عنوان مکانیزم غالب برای سنتز استیل-کوآنزیم A از CO₂ استفاده می کنند [۱۱]. به طور کلی، ارگانیزمهایی که CO را مصرف می کنند این توانایی را دارند که CO₂ و CO₂/H₂ را نیز با استفاده ازهمان آنزیمها و مکانیزم مشابه از طریق مسیر استیل-کوآنزیم A مصرف کنند. در واقع، توانایی میکروارگانیزمها برای تبدیل CO₂ به استات در حضور H₂ مدتها قبل از آنکه به قابلیت این ارگانیزمها برای مصرف CO پی برده شود، کشف شد .[۱۲]
مسیر استیل-کوآنزیمA ورودی پذیرنده الکترون برای فرایندی است که ذخیره کننده انرژی بوده و جذب CO₂ به درون بیومس و اجزای سلولی، به خصوص در ارگانیزمهای اتوتروف، از طریق این مسیر انجام می گیرد[۸۹]. این مسیر متابولیکی برگشت ناپذیر و غیر سیکلی بوده و در شرایط به شدت بی هوازی اتفاق می افتد و فرایند تخمیر باکتریایی استوژنها را هدایت می کند [۸۳, ۹۰]. مقدار ATPخالص تولید شده در این مسیر برای فراهم کردن انرژی لازم برای رشد سلولها صفر می باشد [۸۶]. این مسیر برای سنتز استیل-کوآنزیم A از دو شاخه متیل و کربونیل تشکیل می شود که از طریق آنها CO₂ به وسیله چندین واکنش آنزیمی تا سطح متیل و کربونیل کاهیده می شود. مسیر متابولیکی استیل-کو آنزیم A برای باکتریهای استوژنیک به صورت شماتیک در شکل ۲-۲ ارائه شده است [۱۱, ۱۲, ۲۸, ۲۹, ۷۴, ۹۱].
شکل ‏۲‑۲: مسیر متابولیکی استیل-کو آنزیم A برای باکتریهای استوژنیک
در شاخه متیلِ مسیر متابولیکی استیل-کوآنزیمA ، در مرحله اول CO₂ طبق واکنش زیر به فرمات (HCOO^-) کاهیده می شود [۹۲]:
CO₂ + NADPH → HCOO^- + NADP⁺ (۲-۵)
این واکنش به صورت برگشت پذیر توسط آنزیم فرمات دی هیدروژناز^[۱۰۹] که CO₂ را به فرمات کاهش می دهد کاتالیز می شود [۱۱, ۹۲]. فرمات تولید شده به عنوان ماده اولیه در سنتز شاخه متیلِ مسیر استیل-کوآنزیم A عمل می کند. فرمات توسط تتراهیدروفولیت^[۱۱۰](H₄folate) فعال شده و توسط آنزیم سنتزکننده۱۰-فرمیل-تتراهیدروفولیت^[۱۱۱] و واکنش زیر به ۱۰-فرمیل-تتراهیدروفولیت تبدیل می شود [۱۴, ۹۲]:
HCOOH + H₄folate + ATP → HCO-H₄folate + ADP + P_i (۲-۶)
آنزیم سیکلوهیدرولاز^[۱۱۲] این ترکیب واسطه را به ۱۰و۵-متنیل-تتراهیدروفولیت سیکلوهیدروژناز^[۱۱۳] تبدیل می کند [۱۴, ۹۲]:
HCO-H₄folate + H⁺ → CH-H₄folate⁺ + H₂O (2-7)
در واکنش کاهشی بعدی که به NADPH وابسته است، ۱۰و۵-متنیل-تتراهیدروفولیت توسط آنزیم متیلن-تتراهیدروفولیت دی هیدروژناز^[۱۱۴] به ۱۰و۵-متیلن-تتراهیدروفولیت کاهیده می شود [۱۴, ۹۲]:
CH-H₄folate⁺ + NADPH → CH₂-H₄folate + NADP⁺ (۲-۸)
سپس آنزیم متیلن-تتراهیدروفولیت رداکتاز^[۱۱۵] این ترکیب واسطه را به (S6)-5-متیل-تتراهیدروفولیت کاهش می دهد [۹۲]:
CH₂-H₄folate + ferredoxin_red → CH₃-H₄folate + ferredoxin_ox (۹-۲)
در آخرین مرحله از سنتز متیل، متیل-تتراهیدروفولیت به مرکز کبالت پروتئینِ کرینوئید/آهن-سولفور منتقل می شود. برای آنکه کرینوئید یک گروه متیل از ۵-متیل-تتراهیدروفولیت بپذیرد باید حتما کاهیده شود. این کاهش توسط فردوکسین کاهش یافته انجام می شود که ممکن است از پیروات و پیروات-فردوکسین اکسیدرداکتاز^[۱۱۶] یا CO و CODH مطابق واکنش زیر تولید شده باشد [۹۲]:
[Co⁺³-E] + 2ferredoxin_red → [Co⁺-E] + 2ferredoxin_ox (۲-۱۰)
سپس، کرنوئید کاهش یافته توسط آنزیم ترنس متیلاز^[۱۱۷] طبق واکنش زیر کاهیده می شود [۹۲]:
[Co⁺-E] + CH₃-H₄folate → [CH₃-Co-E] + H₄folate (2-11)
در شاخه کربونیلِ مسیر متابولیکی استیل کوآنزیم A، یک گروه کربونیل تشکیل می شود که سپس با گروه متیل که در شاخه متیل سنتز شده است در هم می پیوندند تا استیل کوآنزیم A به وجود آید. آنزیم CODH نقش مهمی را در شاخه کربونیل ایفا می کند. این آنزیم CO₂ را مطابق واکنش زیر به CO کاهش می دهد [۱۱]:
CO₂ + ۲H⁺ + ۲e^- → CO + H₂O (2-12)
آنزیم کلیدی Ni-CODH به دو گروه تقسیم می شود: ۱) CODH تک عملکردی؛ واکنش اکسیداسیون CO به CO₂ را کاتالیز می کند که متعاقبا می تواند به فرمات و سپس گروه متیل در مسیر استیل کوآنزیمA کاهیده شود و ۲) CODH دو عملکردی؛ CO₂را هنگامی که گروه کربونیل در مسیر استیل کوآنزیمA سنتز می شود به CO کاهش می دهد و همچنین همراه با آنزیم سنتز کننده استیل کوآنزیم A (ACS)، استیل کوآنزیم Aرا تولید می کند [۱۴]. در آخرین مرحله از سنتز استیل کوآنزیم A، CO (نیمه کربونیل) با گروه Co-متیلِ کرنوئید متیل دار شده (نیمه متیل) و کوآنزیم A متراکم می شود تا استیل کوآنزیم A را مطابق واکنش (۲-۱۳) تولید کند. این واکنش کاهشی در حضور آنزیمهای CODH/ACS انجام می گیرد [۱۴, ۹۲]:
[CH₃-Co-E] + CO + HS-CoA → CH₃COS-CoA + [Co-E] (2-13)
استیل کوآنزیمA تولید شده یک ماده اولیه ایده ال برای سنتز اجزای سلولی همچون اسیدهای آمینه، نوکلئوتیدها، لیپیدها و کربوهیدراتهاست [۹۲]. استیل کوآنزیم A می تواند به عنوان منبع کربن و انرژی در مسیر آنابولیکی و کاتابولیکی مورد استفاده قرار گیرد. در مسیر آنابولیک، استیل کوآنزیم A در حضور آنزیم سنتز کننده پیروات^[۱۱۸] به پیروات کربوکسیله می شود. سپس، پیروات به فسفوانول پیروات^[۱۱۹] که یک ترکیب واسطه در تشکیل اجزای سلولی است تبدیل می گردد. در مقابل، در مسیر کاتابولیکی، استیل کوآنزیم A دستخوش یک سری واکنش می شود تا ATP و استات تولید کند. تبدیل استیل کوآنزیم A به استات از طریق تشکیل استیل-فسفات(CH₃COO-P₃^2-) به عنوان یک ترکیب واسطه صورت می گیرد[۱۱, ۷۴] :
CH₃COS-CoA + Pi → CH₃COO-P₃^2- + HS-CoA (2-14)
واکنش (۲-۱۴) توسط آنزیم فسفوترانس استیلاز^[۱۲۰] کاتالیز می شود. در واکنش بعدی، استیل-فسفات به استات تبدیل می شود در حالیکه یک مولکول ADP در حضور آنزیم استات کیناز^[۱۲۱] به ATP فسفریله می شود [۷۴]:
CH₃COO-P₃^2- + ADP → CH₃COOH + ATP (2-15)
این مرحله از متابولیزم که منجر به تولید استات می شود اغلب به عنوان فاز استوژنیک (تولید اسید) شناخته می شود و باکتریهای استوژنیک آن را به مسیری که منجر به تولید الکل می شود ترجیح می دهند. تبدیل استیل کوآنزیم A به استات و ATP در فاز رشد انجام می گیرد، در حالیکه تولید اتانول و NADP در فاز عدم رشد^[۱۲۲] صورت می پذیرد. بنابراین، در فاز سالونتوژنیک^[۱۲۳] (تولید حلال) که اتانول از استیل کوآنزیم A تولید می شود رشد سلولی کند بوده و هیچ مولکول ATP ای در این فاز تولید نمی شود. در این فاز از فرایند تخمیر، پتانسیل کاهشی به شکل NADH توسط ارگانیزم مصرف می شود تا در حضور آنزیم استالدئید دی هیدروژناز^[۱۲۴]، استالدئید (CH₃CHO) تولید کند [۱۱]:
CH₃COS-CoA + NADH + H⁺ → CH₃CHO + NAD⁺ + HS-CoA (2-16)
CH₃CHO + NADH + H⁺ → CH₃CH₂OH + NAD⁺ (۲-۱۷)
استالدئید تولید شده در حضور آنزیم الکل دی هیدروژناز^[۱۲۵] به اتانول تبدیل می گردد.
عوامل موثر در تخمیر گاز سنتز
پارامترهای متعددی در فرایند تخمیر گاز سنتز نقش دارند که عبارتند از: ترکیب و غلظت مواد مغذی، دما، pH محیط کشت، میزان مایه تلقیح^[۱۲۶]، شدت جریان گاز و مایع، سرعت همزدن، حداکثر غلظت گاز که بازدارنگی سوبسترا ایجاد نمی کند و حداکثر غلظت محصول در محیط کشت که موجب بازدارندگی محصول نمی شود [۲۰]. مقدار بهینه این پارامترهای عملیاتی باید به درستی تعیین و به کار گرفته شود تا موجب بهبود رشد سلول و بازده محصول در فرایند تخمیر شود.
تاثیر ترکیب محیط کشت
باکتری به عنوان یک موجود زنده نیاز به منبع انرژی برای رشد و زنده ماندن دارد. همه باکتریها به عناصری مانند کربن، نیتروژن، سولفور و فسفر برای سنتز اجزای سلولی و محصول نیازمندند [۲۱]. در فرایند تخمیر گاز سنتز، اجزای گاز سنتز به عنوان منبع کربن و انرژی توسط باکتری مصرف می گردند. علاوه بر اینها، سلولها به مواد معدنی و ویتامینهای متعددی نیاز دارند تا فعالیت متابولیکی خود را در حد بالایی حفظ کنند [۱۴].
فرضیه ای وجود دارد که تولید حلال (الکل) به جای اسید توسط باکتریهای استوژنیک در شرایط عدم رشد بهبود می یابد که چنین شرایطی ممکن است با کمبود مواد مغذی (مثلا کمبود کربن، نیتروژن و فسفر در محیط کشت)، افزودن عوامل کاهنده^[۱۲۷]، تغییر محدوده pH، افزودن هیدروژن و تغییر اجزای محیط کشت ایجاد شود [۱۴, ۴۵, ۹۳]. مطالعه مسیر متابولیکی استیل کوآنزیم A نشان داده است که تولید استات از نظر میزان ATP موازنه است، درحالیکه، تولید اتانول موجب افزایش مصرف ATP می گردد که موجب رشد سلول نخواهد شد. بنابراین، برای افزایش میزان اتانول تولیدی نسبت به استات، می بایست عواملی که موجب رشد سلول نمی شوند مورد توجه قرار گیرند. پس از آنکه رشد سلول در محیط کشت به میزان مطلوبی رسید باید شرایطی حاکم شود که سلولها را در حالت عدم رشد قرار دهد [۴۵, ۵۴, ۹۳]. چنین شرایطی توسط فیلیپس و همکارانش^[۱۲۸][۴۱] برای بهینه سازی محیط کشت باکتری کلستریدیوم لانگالی به منظور افزایش تولید اتانول نسبت به استات مورد بررسی قرار گرفت. آنها غلظت ویتامین B را کاهش داده و عصاره مخمر^[۱۲۹] را از محیط کشت حذف کردند. در نتیجه، رشد سلول به میزان کمی کاهش یافت، اما اتانول به عنوان محصول عمده در مقایسه با استات تولید گردید. حداکثر میزان اتانول تولید شده در بیوراکتور همزن دار و در حالت پیوسته ۴۸ و ۲۳ گرم در لیتر با و بدون بازیافت سلول بود. در حالت بازیافت سلول، آنها موفق شدند ۲۱ مول اتانول به ازای هر مول استات تولید کنند. در آزمایشی دیگر، گدی و همکارانش^[۱۳۰] [۷۸] تاثیر غلظت عصاره مخمر در محیط کشت را روی توزیع محصول باکتری لانگالی در شرایط ناپیوسته مورد بررسی قرار دادند. در غلظتهای پائین عصاره مخمر (۰۰۵/۰، ۰۱/۰ و ۰۵/۰%) نسبت مولی اتانول به استات ۱۱/۰ بود، در حالیکه، این نسبت در غلظتهای بالاتر عصاره مخمر (۱/۰ و ۲/۰%) به ۰۵/۰ کاهش یافت. این نتایج بهبود تولید اتانول در شرایط عدم رشد را که با کاهش غلظت عصاره مخمر ایجاد شده بود تائید کرد. در آزمایشهای دیگری که توسط کلاسون و همکارانش^[۱۳۱][۴۵] انجام گرفت، اهمیت ترکیب محیط کشت در تخمیر ناپیوسته باکتری لانگالی مطالعه گردید. فرضیه ای وجود داشت که ناچار کردن باکتریها به رشد با یک نرخ کاهش یافته موجب اسپورزایی^[۱۳۲] شده و تولید اتانول را بهبود می بخشد. در طول فرایند تخمیر، گاز سنتز به عنوان منبع کربن اولیه بود اما عصاره مخمر با سلوبیوز^[۱۳۳]، رامنوز^[۱۳۴]، گالاکتوز^[۱۳۵] و نشاسته، هر کدام در آزمایشهای جداگانه، جایگزین گردید. استفاده از این مواد مغذی به جای عصاره مخمر موجب اسپورزایی گردیده و رشد سلول، تولید اتانول و نسبت محصولات را افزایش داد. بیشترین غلظت سلولی ۱۷۰ میلی گرم در لیتر، اتانول ۵۶/۰ میلی مول و نسبت اتانول به استات ۴۵/۰ با سلوبیوز حاصل گردید.
کمبود مواد مغذی در محیط کشت می تواند محدودیتهایی را در متابولیزم سلولی مانند نگهداری سلول، تولید آنزیمهای درون سلولی و تشکیل کوفاکتورها ایجاد کند. چنین شرایطی موجب به وجود آمدن حالت عدم رشد یا سلولهای در حال استراحت^[۱۳۶] می شود که مسیر متابولیکی باکتریها را از فاز تولید اسید به فاز تولید الکل جابجا می کند. با این حال، چنانچه قابلیت حیات سلولها در محیط کشت کم باشد و سطح فعالیت متابولیکی سلولها بسیار پائین باشد، ممکن است سلولها نتوانند آنزیمهای درست و کوفاکتورهایی مانند استالدئید دی هیدروژناز، استات کیناز و NADH را تولید کنند یا حاملهای الکترون را برای جذب سوبسترای کربنی یا ترکیبات واسطه متابولیکی مصرف کنند [۹۳]. در تحقیقی برای ایجاد شرایط عدم رشد به منظور افزایش تولید اتانول، کاتر و همکارانش^[۱۳۷] [۹۳]، تاثیر کمبود نیتروژن در محیط کشت را روی توانایی تولید اتانول و استات باکتریهای کلستریدیوم اتواتانوژنوم و لانگالی مورد بررسی قرار دادند. کلرید آمونیوم، پپتون پروتئوز^[۱۳۸]، عصاره مخمر و عصاره گوشت گاو^[۱۳۹] به عنوان منابع نیتروژن در محیط کشت مورد استفاده قرار گرفتند. آنها در آزمایشات خود هیچ تولید اتانولی (و یا مقدار بسیار اندکی) را در سلولهای لانگالی که در حالت عدم رشد بودند مشاهده نکردند. این مساله احتمالا به دلیل عملکرد ضعیف متابولیکی سلولها بوده است که نمی توانستند سوبسترا را مصرف کنند، همانگونه که تغییرات کمی در میزان مصرف سوبسترا مشاهده گردید. در مقابل، توانایی تولید اتانول در محیط کشت باکتری اتواتانوژنوم افزایش یافت که نشان می داد این باکتری نسبت به کمبود نیتروژن بسیار حساس بود. مانس و ویور^[۱۴۰] [۹۴]، سنتز پلی-۳-هیدروکسی آلکانوات^[۱۴۱] (PHA) را از سوبسترای گازی (CO و H₂) در محیط کشت نامتوازن گونه ای از باکتری رودوباکتر^[۱۴۲] مطالعه کردند. پلیمر PHA یک ترموپلاستیک با وزن مولکولی بالاست که به عنوان جزئی از توده سلولی شکل می گیرد و می توانند با بهره گرفتن از حلال استخراج گردد. آنها مشاهده کردند که در محیط کشت نامتوازن که در آن رشد سلولها با کمبود نیتروژن، نمکهای اصلی (MgSO₄، CaCl₂ و FeSO₄) و ویتامینهای ضروری محدود شده بود، تا حدود ۲۸% از وزن سلولی مربوط به گرانولهای PHA بود. با توجه به این نکته که بازده تولید PHA به نوع و میزان اسیدهای آلی موجود در محیط کشت بستگی داشت، با افزودن استات به محیط کشت، میزان PHA در وزن خشک سلول به ۷۹% افزایش یافت.
از آنجا که هزینه تمام شده محیط کشت یکی از شروط مهم برای تولید سوختهای بیولوژیکی در مقیاس صنعتی است، تلاشهایی در جهت کاهش این هزینه انجام شده است. کاندیانا و همکارانش^[۱۴۳] [۸۳] از عصاره پنبه دانه^[۱۴۴]، بدون افزودن هیچ ترکیب دیگری، به عنوان محیط کشت گونه ای از باکتری کلستریدیوم (P11)^[145] برای تولید اتانول استفاده کردند. آنها اظهار داشتند که عصاره پنبه دانه حاوی برخی ترکیبات معدنی و ویتامینها بود که بسیار به محیط کشت استاندارد این باکتری شباهت داشت و همچنین محتوی هیجده اسید آمینه بود. در محیط کشت ناپیوسته که حاوی ۵/۰ گرم در لیتر عصاره پنبه دانه بود، پس از ۱۵ روز، ۶۶/۲ گرم در لیتر اتانول تولید گردید، در حالیکه، غلظت استات در محیط بسیار کم بود. آنها پیشنهاد کردند که جایگزینی اجزای محیط کشت استاندارد این باکتری از جمله نمکهای معدنی و ویتامینها با عصاره پنبه دانه می تواند هزینه فرایند را تا میزان زیادی کاهش دهد.
تاثیر منبع آلی
منوکسید کربن به عنوان یکی از اجزای اصلی گاز سنتز یا هر گاز دودکش دیگری علاوه بر سمیت بالایش یک ماده اولیه تجدیدپذیر مناسب برای فرایندهای تخمیر میکروبی است. منوکسید کربن می تواند توسط باکتریهای مختلفی از جمله کربوکسیدوترفهای هوازی^[۱۴۶]، استوژنهای بی هوازی، فتوتروفها، باکتریهای کاهنده سولفور و متانوژنها متابولیز شود [۹۵]. هرچند، فرایند تخمیر بی هوازی CO ارجحیت دارد چرا که از الکترونهای موجود برای تولید ترکیبات بیوشیمیائی کاهش یافته به جای از بین رفتن برای تولید اکسیژن استفاده می گردد [۸۱]. میکروارگانیزمهای بی هوازی که می توانند به صورت کمولیتوتروف روی سوبستراهایی مانند CO و H₂/CO₂، که از اجزای اصلی گاز سنتزند، رشد کنند و یا به صورت کموارگانوتروف با منابع کربنی نظیر فروکتوز، استات، مالات^[۱۴۷]، گلوتامات^[۱۴۸]، فرمارات^[۱۴۹]، سوکسینات^[۱۵۰] و پیروات رشد کنند، گزینه های مناسبی برای این منظور هستند. آنها سوبستراهایی نظیر CO و CO₂ را در طی فرایند تخمیر مصرف می کنند تا انرژی لازم برای رشد و نگهداری باکتری را فراهم کرده و همچنین محصولات جانبی ای همانند اسیدهای آلی و الکلها و هیدروژن را متابولیز می کنند [۸۲].
کاتر و همکارانش^[۱۵۱] [۷۹] رشد باکتری لانگالی را روی گاز سنتز (۵۰% N₂، ۲۰% CO، ۲۰% CO₂ و ۱۰% H₂) با فروکتوز مقایسه کردند. رشد باکتری روی کربن قندی منجر به تولید محیط کشتی غلیظ ( ۱ گرم بر لیتر) در مقایسه با گاز سنتز (۵۶۲/۰ گرم بر لیتر) گردید. همچنین غلظت اتانول تولید شده با فروکتوز (۱۳ میلی مول در لیتر) بسیار بالاتر از گاز سنتز (۸/۳ میلی مول در لیتر) بود. این تفاوت در عملکرد سلولها احتمالا به دلیل محدودیتهای نفوذ درسطح مشترک گاز-مایع و/یا راندمان جذب و مکانیزم انتقال سوبسترای گازی بوده است. آنها همچنین در فرایند تخمیر گاز سنتز مشاهده کردند که تلقیح کردن محیط کشت با سلولهایی که با فروکتوز رشد داده شده موجب دانسیته سلولی بالاتر (۸۵۰/۰ گرم بر لیتر) در مقایسه با سلولهایی شدند که با گاز سنتز رشد داده شدند (۵۶۲/۰ گرم بر لیتر). از این نتایج چنین استدلال گردید که این تفاوت در عملکرد محیط کشت احتمالا به دلیل حضور مقادیر بیشتری از کوفاکتورهای درون سلولی، آنزیمها و انرژی در سلولهایی بود که با سوبسترای قندی رشد داده شده بودند. در آزمایشهای دیگری [۹۶]، آنها تاثیر عادت دادن سلول (مایه تلقیح) به منابع کربنی متفاوت (فروکتوز، فروکتوز-گاز سنتز و گاز سنتز) را روی رشد سلول و تولید محصول درفرایند تخمیر گاز سنتز بررسی کردند. بیشترین میزان رشد سلول و تولید اتانول از سلولهایی به دست آمد که از قبل به فروکتوز عادت داده شده بودند. تولید اتانول توسط این سلولها تقریبا ۵/۲ و ۵/۱ برابر سلولهایی بود که به گاز سنتز و فروکتوز-گاز سنتز عادت کرده بودند. عادت دادن سلولها به مصرف فروکتوز احتمالا سطح بالاتری از معادلهای انرژی (ATP/GTP) و توان کاهشی (NADH/NADPH) را برای مصرف گاز سنتز به عنوان منبع کربنی برای سلولها فراهم می کرد. گدی و همکارانش^[۱۵۲] [۳۰] باکتری باسیلوس سیمیتی^[۱۵۳] را که قادر به مصرف سریع CO و تولید هیدروژن بود جداسازی کردند. گونه بی هوازی ERIH2 در کاتالیز کردن واکنش جابجائی آب-گاز بیولوژیکی بسیار فعال بود و نرخ مصرف CO بالایی، تقریبا ۲۰ برابر باکتری روبروم در محیط کشت ناپیوسته، بدون نیاز به نور از خود نشان داد. اما، سلولها نرخ رشد ضعیفی داشتند. بنابراین، از برخی مکملهای رشد در محیط کشت باکتری استفاده گردید تا موجب تحریک رشد سلول شوند. محیط کشت حاوی ویتامینها، نمکها، مواد معدنی، تریپتیکیس^[۱۵۴]، عصاره مخمر و گلوکز به عنوان منبع کربنی ارزان بود. نتایج این تحقیق نشان داد که در طول ۸ ساعت اول انکوباسیون، غلظت سلول به صورت قابل توجهی افزایش یافت، اما رشد سلول عمدتا بر روی تریپتیکیس و عصاره مخمر بود و مصرف گلوکز در این زمان کم بود. بعد از این ۸ ساعت، گلوکز با نرخ بالاتری مصرف گردید. بنابراین، این طور استنباط شد که عبور گلوکز از غشاء سلولی مرحله محدود کننده رشد بوده است. از آنجا که باکتری ERIH2، CO را به عنوان منبع کربن برای رشد مصرف نمی کرد، غلظت مناسبی از گلوکز مورد نیاز بود تا دانسیته سلولی بالایی را به وجود آورد. آنها به این نتیجه رسیدند که استفاده از یک محیط کشت غنی حاوی ۲۵ گرم در لیتر گلوکز، ۵ گرم در لیتر تریپتیکیس و ۲۰ گرم در لیتر عصاره مخمر منجر به غلظت بالای سلولی (۵ گرم در لیتر) گردید. در بررسی دیگری که توسط نجف پور و همکارانش [۶۱] انجام شد، تاثیر منابع قندی متفاوت روی رشد سلول و بازده تولید هیدروژن در واکنش جابجائی آب-گاز بیولوژیکی توسط باکتری روبروم مطالعه گردید. باکتری روبروم روی سه کربوهیدرات گلوکز، فروکتوز و ساکاروز و سه اسید آلی فرمات، استات و مالات رشد داده شد. فاز گاز حاوی ۵۵% CO، ۲۰% H₂، ۱۰% CO₂ و ۱۵% Ar بود. بالاترین بازده تولید بیومس (۴۷/۰ گرم سلول به گرم سوبسترا) از فروکتوز حاصل گردید، درحالیکه، استات مطلوبترین سوبسترا برای دستیابی به بیشترین بازده تولید هیدروژن (۸۶/۰ میلی مول H₂ به میلی مول CO) بود. آنها همچنین به این نتیجه رسیدند که مالات برای رشد سلول، و نه برای تولید H₂، سوبسترای مناسبی بود. در این تحقیق، استات به عنوان منبع کربنی مطلوب برای تولید هیدروژن پیشنهاد گردید چرا که استات می توانست به استیل کوآنزیم A تبدیل شده و وارد چرخه اسیدهای کربوکسیلیک^[۱۵۵]، که مسیر متابولیکی تولید H₂ در باکتریهای غیر-سولفوری ارغوانی است، شود [۹۷]. در تحقیق دیگری برای تعیین تاثر اجزای محیط کشت روی تولید اتانول و استات، گدی و همکارانش [۷۸] از محیط کشتی حاوی عصاره مخمر، نمکهای معدنی و ویتامینها بدون هرگونه منبع کربنی مانند CO یا گاز سنتز برای کشت باکتری لانگالی استفاده کردند. در این آزمایش، با وجود آنکه هیچ الکلی در محیط تولید نشد، اما مقدار قابل ملاحظه ای اسیدهای آلی تولید گردید که احتمالا به دلیل استفاده از عصاره مخمر به عنوان منبع کربنی در این شرایط توسط باکتریها بوده است.
تاثیر pH محیط کشت
یکی از عوامل موثر در تنظیم متابولیزم سوبسترا و تغییر پارامترهای فیزیولوژیکی از جمله pH داخلی، پتانسیل غشایی و نیروی محرک پرتون، pH محیط کشت است. بنابراین، pH محیط روی آزاد سازی محصولات متابولیکی، گزینش پذیری محصول و ترکیب آن نقش موثری دارد [۹۸]. برای هر ارگانیزمی محدوده pH ای وجود دارد که سلولها درآن ناحیه از نظر متابولیکی فعال هستند. هرگونه تغییری در این pH می تواند منجر به آسیب سلولها و حتی مرگ آنها شود که متعاقبا موجب کاهش فعالیت بیولوژیکی آنها می گردد. کاهش pH محیط کشت که با کم شدن جریان کربن و الکترون از سوبسترا به سمت توده سلولی همراه است موجب تضعیف رشد سلولها شده و روی بازده کلی تولید محصول در فرایند تاثیر می گذارد. هرچند، در مورد باکتریهای استوژنیک، این مساله یک حسن محسوب می گردد چرا که موجب جابجایی طیف محصول از فاز استوژنیک به فازسالونتوژنیک می شود که برای تولید محصولات کاهش یافته ای نظیر اتانول مطلوب است [۱۴]. در چنین مواردی، اسید استیک تولید شده که یک اسید آلی ضعیف است از میان غشاء سلولی به درون سلول نفوذ می کند. در هنگام نفوذ از دیواره سلولی، اسید استیک یونهای H⁺ را هدایت می کند و موجب کاهش pH درون سلولی می شود. هنگامی که pH درون سلولی کاهش یافت، pH بیرونی نقش مهمی را در خنثی کردن این شرایط با تولید حلال ایفا می کند [۸۳].
در تلاشی برای تولید بوتیرات از CO خالص توسط باکتری بوتیریباکتریوم متیلوتروفیکوم^[۱۵۶]، وردن و همکارانش^[۱۵۷] [۸۱] تاثیر pH محیط کشت را به عنوان عاملی موثر برای تحریک تولید بوتیرات مورد آزمایش قرار دادند. آزمایشهای ناپیوسته که با عبور پیوسته جریانی از CO همراه بود در۸/۶=pH آغاز گردید که در این حالت استات در محیط تولید شد اما هیچ تولید بوتیراتی مشاهده نگردید. بنابراین، در شروع فاز سکون با غلظت سلولی ۳/۰ گرم بر لیتر، pH از ۸/۶ به ۶ کاهش داده شد. در نتیجه، افزایش قابل توجهی در تولید بوتیرات به جای استات حاصل گردید. در این فرایند، مقدار ۶ گرم بر لیتر بوتیرات تولید شد. با وجود آنکه مکانیزمی که از طریق آن pH محیط روی تولید محصول تاثیر می گذاشت برای آنها مشخص نبود، آنها بر این عقیده بودند که این مساله به برخی تغییرات آنزیمی در تبدیل کاهشی استیل کوآنزیم A به بوتیرات مربوط می شد. بدین ترتیب که pH محیط کشت روی عملکرد آنزیمهای درگیر دراین فرایند به صورت مستقیم از طریق بازدارندگی pH و یا غیر مستقیم توسط واسطه ای که تحت تاثیر pH است، احتمالا بی کربنات، تاثیر می گذارد. برای امتحان درستی این فرضیه، آزمایشهای ناپیوسته مشابهی با جریان گازی حاوی ۸۰% CO و ۲۰% CO₂ در ۸/۶ pH= انجام شد. از CO₂ برای افزایش غلظت بی کربنات در فاز مایع استفاده گردید، اما نسبت استات به بوتیرات با افزایش CO₂ تغییر چندانی نیافت. بنابراین، آنها به این نتیجه رسیدند که احتمالا بی کربنات تنظیم کننده متابولیکی اولیه نبوده است. در مقابل، نتایج با فرض اثرگذاری pH به صورت مستقیم همخوانی بیشتری داشتند. برای میزان معادلی از COکه در فرایند تخمیر مصرف می شود، اسید استیک تولید شده محیط را بیش از اسید بوتیریک اسیدی می سازد چرا که ۵/۲ برابر بیشتر از اسید بوتیریک گروه کربوکسیل تولید می کند. پس در pH های پائین محیط کشت، تولید اسید بوتیریک به استات ارجحیت دارد تا از کاهش بیشتر pH محیط جلوگیری کند.
گدی و همکارانش [۷۸] نشان دادند که باکتری لانگالی در شرایط بهینه رشد (۷-۵=pH)، به جای اتانول، استات تولید می کند، در حالیکه اتانول به جای استات در شرایط عدم رشد در ۵/۴-۴=pH و بدون حضور عصاره مخمر تولید می گردد. با دانستن این موضوع، آنها از دو بیوراکتور همزن دار پیوسته به صورت سری استفاده کردند تا میزان تولید اتانول را افزایش دهند. در بیوراکتور اول pH روی ۵ تنظیم شد تا موجب افزایش رشد سلول شود و در بیوراکتور دوم pH به حدود ۵/۴-۴ کاهش داده شد و عصاره مخمر از محیط کشت حذف گردید تا رشد سلولی متوقف شده و تولید اتانول آغاز گردد. در نتیجه این تغییرات، با جریان گازی حاوی ۲۵/۵۵% CO، ۶۱/۱۰% CO₂، ۱۱/۱۸% H₂ و ۷۸/۱۵% Ar، میزان اتانول تولیدی در بیوراکتور اول و دوم به ترتیب به ۱ و ۳ گرم در لیتر رسید و نسبت مولی اتانول به استات از ۱ در بیوراکتور اول به ۴ در بیوراکتور دوم بهبود یافت. این نتایج نشان می دهد که تغییر pH بین دو بیوراکتور و کمبود عصاره مخمر قدم مهمی در افزایش تولید اتانول به جای استات بوده است.
سکائی و همکارانش^[۱۵۸] [۴۴] باکتری گرمادوستی از گونه مورلا^[۱۵۹] را از یک نمونه گِل که از چشمه آب گرم زیرزمینی جمع آوری شده بود جداسازی کردند که می توانست از H₂ و CO₂ در دمای ۵۵ درجه سانتیگراد اتانول تولید کند. فاز گازی حاوی ۸۰% H₂ و ۲۰% CO₂ به داخل سرم باتل فرستاده شد و فشار داخل باتل به ۱۹/۰ مگاپاسکال رسانده شد. پس از گذشت زمان ۱۵۶ ساعت، ۵/۱ میلی مول اتانول و ۵۷ میلی مول استات تولید گردید. تجمع استات در محیط کشت موجب کاهش شدیدی در pH محیط کشت گردید که بازدارندگی برای رشد سلول و تولید محصول ایجاد نمود. بنابراین، آزمایشهای جدیدی در فرمانتور که به منبع گاز متصل بود انجام شد که در آن pH محیط کشت قابل کنترل بود. کنترل pH محیط کشت در ۲/۶ منجر به تولید ۳۴۷ میلی مول استات در زمان ۲۲۰ ساعت گردید، اما تولید اتانول افزایش نیافت. از آنجا که ۵= pHبرای تولید اتانول مناسب بود، آزمایشها در pH رشد یعنی ۳/۶ آغاز گردید اما پس از کاهش اولیه، pH روی ۵ کنترل شد. در این محیط کشت ناپیوسته همراه با کنترل pH، حداکثر میزان اتانول تولیدی به ۸/۴ میلی مول رسید. رشد سلول و تولید اتانول و استات در محیط کشت به ترتیب ۳/۱، ۷/۳ و ۴/۲ بالاتر از شرایطی بود که pH محیط کشت کنترل نشد.
تاثیر عامل کاهنده^[۱۶۰]
آن دسته از باکتریها که نمی توانند در محیطی با پتانسیل کاهشی^[۱۶۱] بالا رشد کنند به عنوان باکتریهای لزوما بی هوازی^[۱۶۲] تعریف می شوند. پتانسیل کاهشی یا پتانسیل اکسیداسیون/احیاء نمایانگر تمایل یک سوبسترا یا محلول برای به دست آوردن الکترون و در نتیجه کاهیده شدن است. در محیط کشت، پتانسیل کاهشی با وجود اکسیژن افزایش می یابد که بازدارنده رشد باکتریهای لزوما بی هوازی است. بنابراین، تقلیل پتانسیل کاهشی محیط رشد برای کشت باکتریهای بی هوازی ضروری است. برای این منظور، عامل کاهنده به عنوان یکی از ترکیبات شیمیائی ضروری به محیط رشد افزوده می شود تا پتانسی کاهشی محیط را کم کند. در واقع، عامل کاهنده پتانسیل کاهشی محیط را کم می کند و آن را در مقدار بهینه قرار می دهد. برخی از عوامل کاهنده متداول عبارتند از: سیستئیسن اسیدی^[۱۶۳]، سدیم سولفید^[۱۶۴]، دیتیوتریتول^[۱۶۵]، سدیم تیوگلیکولات^[۱۶۶]، اسید آسکوربیک^[۱۶۷]، تیتانیوم (III)-سیترات^[۱۶۸]، فریسیانید پتاسیم^[۱۶۹]، متیل وایولوژن^[۱۷۰] و بنزیل وایولوژن^[۱۷۱] [۱۴, ۹۹-۱۰۱].
براساس گزارشهای موجود در متون، افزودن عامل کاهنده به محیط کشت باکتریهای کلستریدیوم در جابجائی متابولیزم باکتری به سمت فاز سالونتوژنیک موثر است. این مساله به در دسترس بودن مقادیر بیشتری از معادلهای کاهنده برای باکتری مربوط می شود که باکتری می تواند NADH لازم برای تبدیل استیل کوآنزیم A به اتانول را بسازد [۱۴]. در واقع، این عوامل کاهنده مسیر حرکت الکترونها را تغییر داده و جریان کربن را به سمتی هدایت می کنند که منجر به تولید اتانول به جای اسید شود. کلاسون و همکارانش^[۱۷۲][۴۵] امکان افزایش تولید اتانول به جای استات را در محیط کشت ناپیوسته باکتری لانگالی با افزودن مقادیر کمی (۳۰، ۵۰ و ۱۰۰ ppm) از عوامل کاهنده مختلف (سدیم تیوگلیکولات، اسید آسکوربیک، متیل وایولوژن و بنزیل وایولوژن) مورد مطالعه قرار دادند. افزودن ۱۰۰ppm عامل کاهنده به محیط کشت در تمامی موارد موجب رشد بسیار کم سلولها گردید. در مقابل، غلظتهای ۳۰ و ۵۰ ppm در بیشتر موارد موجب افزایش تولید اتانول نسبت به اسید گردید. بیشترین نسبت اتانول به استات (۱/۱) و تولید ۷/۳ میلی مول اتانول با بنزیل وایولوژن در غلظت ۳۰ ppm حاصل گردید. آنها به این نتیجه رسیدند که استفاده از عوامل کاهنده که موجب افزایش نسبت محصولات می شد همواره با رشد کندتر باکتری همراه بود چرا که ATP کمتری در فرایند تولید می گردید [۴۵].