رنگ اتیدیوم بروماید (سیناژن، ایران)
Mc Conkey agar
جفت پرایمرهای سنتز شده
ژن فناوران
Triple sugar Iron agar (TSI)
بافر بارکننده (Loading buffer)
Eosin- methylen blue agar (EMB)
۱۰x PCR Buffer
Citrate base medium
dNTPs (سیناژن)
Tryptose soy broth (TSB)
رنگهای رنگ آمیزی گرم
MR/VP medium
۲-۳- روش کار
۱-۲-۳- نمونه گیری
نمونه گیری جهت جداسازی باکتری از ۲۰ واحد تولیدی جوجههای گوشتی واقع در شهرستانهای استان فارس، انجام گرفت. نمونه گیری در سه مرحله انجام شد. نمونهگیری مرحله اول از جوجههای یک روزه داخل کارتن، نمونهگیری مرحله دوم در سنین مابین ۳۵-۲۵ روزگی و نمونهگیری مرحله سوم در هنگام بارگیری انجام شد.
در هر مرحلهی نمونهگیری، از هر فارم ۱۵ سواب کلواکی گرفته شد و بلافاصله در لوله های شیشه ای درپوش دار حاوی محیط TSB قرار داده شد و بلافاصله به آزمایشگاه منتقل شد. در آزمایشگاه ۱۵ سواب کلواکی گرفته شده از هر فارم بصورت سه تایی با هم مخلوط شد و در نهایت از هر فارم پنج محیط TSB ( هرمحیط مخلوط ۳ نمونه) بدست آمد. از هر محیط TSBمخلوط شده با بهره گرفتن از آنس استریل بر روی محیط EMB کشت داده شد و متعاقبا به مدت ۲۴ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد قرار گرفت (در نهایت در هر مرحله نمونه گیری از هر گله ۵ جدایه بدست آمد). از هر کدام از محیط های آگار ائوزین متیلن بلو (EMB agar) که پس از گرمخانه گذاری حاوی کلنی های آبی ـ سیاه با مرکز تیره که جلای فلزی متمایل به سبز داشتند یک پرگنه مجزا برداشته شد و بر روی محیط مککانکی کشت داده شد. پس از ۲۴ ساعت انکوباسیون در ۳۷ درجه سانتی گراد از کلنی های صورتی رنگ مجزا و تکی برای آزمایشهای تاییدی استفاده شد (کوئین و همکاران، ۱۹۹۴الف).
۲-۲-۳- آزمون های تاییدی
رنگ آمیزی گرم: از هر یک از ۵ پلیت مک کانکی کشت داده شده در هر مرحله از نمونه گیری چند کلنی مجزا برداشته شده و پس از تهیه اسمیر بر روی لام و خشک کردن آن توسط حرارت، ابتدا بر روی لام محلول کریستال ویوله ریخته و پس از ۶۰ ثانیه با آب شسته شده و برای تثبیت رنگ به آن لوگول اضافه شده و پس از ۶۰ ثانیه با آب شسته شد. پس از شستشو برای رنگ زدایی به مدت ۱۵ ثانیه الکل استون بر روی لام ریخته شد. در نهایت پس از شستشو با آب، سطح لام به مدت ۶۰ ثانیه با سافرانین پوشانده شد و پس از شستشو با آب و خشک کردن لام در زیر میکروسکوپ مورد بررسی قرار گرفت. باکتری های گرم منفی مانند اشریشیا کولیپس از رنگ آمیزی گرم به رنگ قرمز دیده می شوند درحالیکه باکتری های گرم مثبت بنفش رنگ اند. پس از تایید گرم منفی بودن
نمونه ها پلیت های مربوطه برای انجام آزمایشهای تاییدی بعدی استفاده شدند.
آزمایش کاتالاز: ابتدا یک لوپ از کلونی باکتری را به صورتی که به محیط آگار برخورد نکند برداشته و پس از قرار دادن بر روی یک اسلاید میکروسکوپی تمیز یک قطره هیدروژن پراکسید سه درصد به آن اضافه می شد. جوشیدن گاز هیدروژن در طی چند ثانیه معیار مثبت بودن آزمون کاتالاز در نظر گرفته می شد (اشریشیاکولی کاتالاز مثبت است).
آزمایش اکسیداز: ابتدا تکه ای از یک کاغذ فیلتر در داخل یک پتری دیش با محلول آبی یک درصد تترا متیل پی فنیلن دیامید هیدروکلراید خیس شده و باکتری با بهره گرفتن از یک میله شیشه ای (پیپت پاستور) به روی سطح کاغذ فیلتر کشیده می شد. دیده شدن یک رنگ ارغوانی تیره در امتداد خط کشت در طی ۱۰ ثانیه به عنوان معیار مثبت بودن واکنش در نظر گرفته می شد (اشریشیاکولی اکسیداز منفی است).
نمونه هایی که آزمایش کاتالاز آن ها مثبت و آزمایش اکسیدازشان منفی بود برای انجام آزمایش های تاییدی بعدی مورد استفاده قرار گرفتند.
آزمایش سیترات: با بهره گرفتن از آنس تعدادی کلنی از روی محیط مک کانکی برداشته و روی محیط شیب دار سیمون سیترات کشت داده می شد. اگر در طی ۴۸-۲۴ ساعت پس از انکوباسیون محیط به همان رنگ سبز اولیه باقی میماند، آزمایش سیترات منفی و در صورتی که محیط آبی رنگ می شد، سیترات مثبت در نظر گرفته می شد (اشریشیا کولی سیترات منفی است).
آزمایش لیزین: با بهره گرفتن از آنس به محیط مایع حاوی لیزین دکربوکسیلاز مقداری کلنی باکتری اضافه کرده و سپس برای بیهوازی کردن محیط کشت به آن پارافین اضافه می شد. محیط در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت ۴۸-۲۴ انکوبه می شد. اگر رنگ محیط پس از گذشت این مدت زرد می شد، لیزین منفی و اگر بنفش می شد، لیزین مثبت در نظر گرفته می شد (اشریشیا کولی لیزین مثبت است).
آزمایش اندول: از محیط کشت مک کانکی با بهره گرفتن از آنس بر روی پپتون براث استریل کشت داده و به مدت ۴۸-۲۴ ساعت در ۳۷ درجه انکوباسیون انجام می شد. سپس نیم میلی لیتر واکنشگر کواک به محیط کشت داده شده، اضافه شده و لوله حاوی محیط تکان داده می شد. پس از گذشت یک دقیقه نتیجه قرائت می شد. تشکیل یک لایه قرمز رنگ در سطح محیط براث نشانه نتیجه مثبت و تشکیل یک لایه زرد رنگ، بیانگر نتیجه منفی آزمایش بود (اشریشیا کولیاندول منفی است).
آزمایش متیل رد (MR): پنج میلی لیتر از محیط براث MR-VP را در یک لوله آزمایش ریخته و پس از کشت دادن به مدت ۴۸-۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد، ۵ قطره واکنشگر MR به محیط اضافه شده و لوله به آرامی تکان داده می شد تا واکنشگر در محیط حل شود. اگر رنگ محیط قرمز می شد، نتیجه مثبت و اگر زرد می شد، نتیجه آزمایش منفی در نظر گرفته می شد ( اشریشیا کولی متیل رد مثبت است).
آزمایش ووژ- پروسکوئر (VP): پنج میلی لیتر از محیط براث MR-VP را در یک لوله آزمایش ریخته و پس از کشت دادن بمدت ۴۸-۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد، سه میلی لیتر آلفا نفتول ۵ درصد در اتیل الکل خالص به محیط اضافه شده و سپس یک میلی لیتر هیدروکسید پتاسیم ۴۰ درصد به آن اضافه شده و لوله تکان داده می شد. پس از گذشت ۵ دقیقه اگر محلول بی رنگ بود، آزمایش منفی و اگر اگر قرمز می شد، آزمایش مثبت در نظر گرفته می شد (آزمایش VP در مورد اشریشیا کولی منفی است).
آزمایش اوره: باکتری را در محیط اوره دارای معرف فنل رد کشت داده و پس از ۲۴ ساعت انکوباسیون در ۳۷ درجه سانتیگراد نتیجه خوانده میشد. زرد شدن محیط معیار منفی بودن و قرمز شدن آن معیار مثبت شدن واکنش در نظر گرفته می شد (اشریشیا کولی اوره منفی است).
آزمایش TSI: با بهره گرفتن از آنس چند کلونی از روی محیط مک کانکی برداشته و در محیط TSI شیب دار کشت داده و پس از ۲۴ ساعت انکوباسیون در ۳۷ درجه سانتیگراد نتیجه قرائت می شد. در مورد اشریشیاکولی هم سطح شیب دار و هم سطح پایینی لوله می بایست زرد رنگ می شد.
در صورتی که نتیجه هر یک از آزمایش های مورد نظر با اشریشیا کولی مطابقت نداشت، آزمایش مورد نظر تکرار می شد و در صورت عدم مطابقت دوباره، نمونه مورد نظر دوباره کشت و جداسازی شده و آزمایش های تاییدی بر روی این نمونه جدید انجام می شد.
پس از تایید اشریشیا کولی توسط آزمایشهای بیوشیمیایی نمونه ها، از روی محیط مک کانکی یک کلنی مجزا برداشته و در محیط TSB کشت داده می شد. پس از ۲۴ ساعت انکوباسیون در ۳۷ درجه سانتی گراد، یک میلی لیتر از محیط TSB حاوی باکتری به همراه ۳/. میلی لیتر گلیسرول در میکروتیوبهای استریل ریخته شده و برای نگهداری تا زمان انجام آزمایشات بعدی به فریزر ۷۰- درجه سانتیگراد منتقل شد.
۳-۲-۳- آنتیبیوتیکهای مورد استفاده برای آنتیبیوگرام
جدول ۳-۳: آنتیبیوتیکهای استفاده شده برای آنتیبیوگرام