CaCl₂.2H₂O

۰.۰۱۵

MgSO₄.7H₂O

۰.۰۵

FeCl₃.6H₂O

۰.۰۵۴

٣-٢-مراحل جداسازی باکتری :
مرحله اول جداسازی:
در داخل ارلن ۲۵٠میلی لیتری، ١٠ میلی لیتر نمونه آب به ١٠٠ میلی لیتر محیط کشت Mineral salt medium اضافه شد و در دمای ٣٠ درجه سانتی گراد و به مدت یک هفته و rpm١۷٠ در انکوباتور شیکردار انکوبه شد.
مرحله دوم جداسازی:
١میلی لیتراز فلاسک اول به ١٠٠میلی لیترازمحیط جدیداضافه شد.دمای ٣٠ درجه سانتیگراد وبرای مدت ١هفته وrpm ١۷٠ در انکوباتور شیکردار انکوبه شد .

مرحله سوم جداسازی:
نمونه فلاسک دوم در محیط کشتmedium salt mineral agar Solid کشت داده شده و در دمای ٣٠ درجه سانتی گراد و به مدت ۴- ٣ روز انکوبه شد.بعد از این مدت باکتری ها در محیط رشد کردند و این باکتری ها را در محیط broth Nutrient & agar Nutrient کشت داده شد(۴۴).
٣-٣-شناسایی باکتری:
بعد از جداسازی باکتری ، از طریق رنگ آمیزی گرم و روش میکروسکوپی باکتری بررسی شد. برای تشخیص گونه باکتری در محیط های کشت افتراقی کشت داده شد.تست IMViC انجام شد و باکتری در محیط های سیمون سیترات ، مک کانکی ، MRVP ، TSI کشت داده شد.
٣-۴-سنجش میزان تجزیه فنل توسط باکتری جداسازی شده:
ml ۱ از محلول رویی محیط کشت که باکتری در آن رشد کرده بود برداشته و Hp آن با _۴OS₂(₄NH) به ۱۰رسید و lμ۱۰۰ از _۶(CN)Fe₃K اضافه شد و بعد از این lμ۱۰۰ از Pyrine Anti Amino_ 4 اضافه شد و ۱۵ دقیقه در دمای اتاق گذاشته تا به رنگ قرمز در آید و سپس جذب نوری آن در طول موج ۵۰۰ نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر بررسی شد (۴۵).
١٠٠
٣-۵- Cell concentration:
قبلا یک کاغذ صافی واتمن شماره ١ را برداشته ودر دمای ٨٠ درجه سانتی گراد برای ٢۴ ساعت گذاشته شد ( در داخل فویل آلومینیوم ) و سپس بعد از خشک شدن آن را وزن کردیم. برای اندازه گیری نمونه ها، ارلن ها را تک تک از کاغذ صافی واتمن شماره ١ عبور دادیم و در دمای ٨٠ درجه برای ٢۴ ساعت خشک شد و سپس وزن کاغذ صافی حاوی سلول باکتری را از وزن کاغذ صافی خشک کم کردیم تا وزن خالص بدست آید(۴۶).
_در هر دو آزمایش طراحی شده Burman-Plackett, methodology surface Respons) RSM(، اندازه گیری غلظت فنل و Cell concentration برای همه ی لوله ها انجام گرفت.
٣-۶-روش بهینه سازی و طراحی آزمایش
این طراحی در ٢ مرحله و با دو روش متفاوت با بهره گرفتن از نرم افزار۱۶Minitab انجام شد: الف-طراحی آزمایش ( نرم افزار Burman-Plackett)
ب- طراحی آزمایش (RSM) methodology facesur Response ٣-۶-۱-طراحی آزمایش ( نرم افزار Burman-Plackett):
بعد از جداسازی باکتری به منظور انتخاب بهترین منبع کربن بر اساس طراحی Burman-Plackett ، ۱۲ آزمایش طراحی شد (جدول ۳-۴).بدین منظور سوبستراهایی با ٣ منبع کربن و ٢ منبع ازت با بیشترین و کمترین مقادیر تهیه گردیدند.
منابع کربن شامل آمونیوم سولفات ، منیزیم سولفات و سدیم کلرید است و منبع ازت شامل پپتون، مخمر است . بدین ترتیب بر اساس جدول های شماره ٣-۴و٣-۵ طراحی انجام و غلظت ها انتخاب شد. بدین ترتیب تاثیر متغیرها بر میزان رشد باکتری ها و تجزیه فنل مشخص می گردد.
طراحی آزمایش Burman-Plackett براساس مدل زیر استوار است:
معادله ٣-۱- Y=β۰+ΣβXi
در این مدل _۰Ү پاسخ ( رشد باکتری و تجزیه فنل که به شکل واحد U بیان می گردد) _۰β ثابت مدل، _iβ ضریب خطی ،X_i سطح یا مقدار ابتدایی متغیر است.در این مدل امکان بررسی اثرات متقابل فاکتورهای تاثیر گذار بر پاسخ وجود ندارد و صرفا برای غربالگری و ارزیابی فاکتورهای مهم تاثیرگذار بر پاسخ کاربرد دارد. هر آزمایش تکرار شد و میانگین پاسخ ها بعنوان پاسخ نهایی در نظر گرفته شد.با بررسی آنالیز رگرسیون متغیر ها ، فاکتورهای تاثیرگذار (معنادار) (۰۵/۰>p) برای تولید طی بهینه سازی بعدی به روش RSM مورد استفاده قرار گرفتند(۴۷).
براساس برنامه ریزی انجام شده به روش Burman-Plackett به شرح ذیل۱۲مجموعه آزمایشی به منظور بهترین منبع کربن کمکی (فنل) و ازت (آمونیوم سولفات ، سدیم کلرید ، پپتون ، عصاره مخمر) طراحی گردید ( جدول٣-۴و٣-۵).
جدول۳-۴-طراحی آزمایش Burman-Plackett براساس مقادیر کد شده

Run

فنل
g/l

آمونیوم سولفات
g/l

سدیم کلرید
g/l

پپتون
g/l

مخمر
g/l