حسن پور و همکاران(۱۳۸۶)، بهینه سازی محیط کشت کالوس آوشین شیرازی برای افزایش تولید اسیدرزمارینک (RA) به عنوان متابولیت ثانویه با بهره گرفتن از تغییر شرایط کشت انجام گرفت. بهینه سازی رشد این بافت با محیط گامبورگ و هورمون بنزیل آدنین (mg/L75/0) در شرایط تاریکی صورت گرفت. پس از آن کالوسها در محیط گامبورگ حاوی ساکارز (۳۰ یا ۶۰ g/L). گلوکز(۶۰ و ۷۵ یا ۹۰g/L) و تحت شرایط فتوپریود نوری ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی یا تاریکی کامل قرار گرفتند. تجمع RA در کالوس بالاتر از گیاهچه در شیشه بود و بیشترین مقدار RA (6/15%) با تیمار گلوکز بدست آمد. رشد کالوس در محیط کشت حاوی g/L 75 گلوکز نسبت به محیط حاوی g/L90 گلوکز بیشتر بود. اما اختلاف معنیداری بین سطوح گلوکز برای تولید RA مشاهده نگردید.

اردکانی و همکاران (۱۳۸۴)، بررسی تولید ونگهداری کالوس از بذر گیاه بومادران انجام دادهاند. بررسی توانایی کالوس برای تولید متابولیتهای ثانویه و مقایسه آن با متابولیتهای تولید شده در گیاه کامل بوده است. نتایج بدست آمده نشان داد که بیشترین درصد ترکیبات موجود در اسانس گیاه در آلفا- پینن، بتا– پینن و کاریوفیلن اکساید تشکیل میدهند. در مقابل، کالوس هیچگونه ترکیب اسانسی تولید نکرد. اما بررسی مقدماتی روی عصاره کالوس نشان داد که سلولها، تانن تولید کردهاند. نتایج حاکی از آن است که کالوس بدست آمده از گیاه بومادران در محیط MS و با هورمونهای گیاهی فوق نمیتواند تولید روغن فرار نماید اما کالوس مزبور توانسته است تانن تولید نماید.
اردکانی و همکاران (۱۳۸۳)، در تحقیقی تولید و نگهداری کالوس و توانایی کالوس برای تولید متابولیتهای ثانویه و مقایسه آن با متابولیتهای تولید شده در بذرگیاه رازیانه انجام دادهاند. نتایج بدست آمده نشان میدهد که بیشترین درصد ترکیبات موجود در اسانس گیاه را ترانسآنتول، استراگول و فنچول تشکیل میدهند. در دو محیط دارای (E,E ) 2,4-D کالوسها به میزان ۶۴/۲۲ درصد بودند. نتایج حاکی از آن است که کالوس بدست آمده از گیاه رازیانه در محیط MS و با هورمونهای فوق توانسته است ترکیبات فرار تولید نماید.
احمدی و همکاران(۱۳۹۱)، در تحقیقی بهینه سازی کالوسزایی و سوسپانسیون سلولی در گیاه پروانش (Cathar anthus roseus)، انجام دادهاند. برای این منظور دو آزمایش جداگانه بهینه سازی و کالوسزایی و یک آزمایش بهینه سازی سوسپانسیون سلولی انجام شد. مقایسه میانگین نشان داد که بافت برگ بیشترین کالوس‌زایی را داشت و قطعات ریشه و ساقه در رتبه های بعدی کالزایی بودند. در این آزمایش تیمارهای یک میلی‌گرم در لیتر ۲,۴-D به تنهایی و یا به همراه ۵/۰ میلی‌گرم در لیتر BAP یا KIN بیشترین کالوس را تهیه کردند. در سوسپانسیون سلولی بیشترین وزن خشک سلولی در محیط کشتهای یک میلیگرم در لیتر ۲,۴-D و دو میلیگرم در لیتر ۲,۴-D به همراه یک میلیگرم در لیتر BAP بدست آمد.
تولیت و همکاران (۱۳۸۷)، در بررسی کشت درون شیشهای گیاه ژینکوبیلوبا (Ginkgobiloba L.) از طریق کشت بافت ریزنمونههای مختلف انجام دادهاند. این تحقیق به منظور بررسی کشت درون شیشهایی این گیاه از طریق کشت بافت جهت تعیین بهترین ریزنمونه، محیط کشت و ترکیب هورمونی انجام شد. در این تحقیق فقط کالوس تولید شد و نوساقه بوجود نیامد. نتایج نشان داد که تولید کالوس از ریزنمونه در محیط MS حاوی ترکیب هورمونی mgL BAP5/0 و NAA mg/L1 بیشترین تاثیر را در تولید کالوس داشت.
رضایتمند (۱۳۹۱)، باززایی و تنوعهای سوماتیکی در گیاه شمعدانی عطری (Pelargonium roseuml) با بهره گرفتن از مارکر RAPD و با هدف بهینه سازی شرایط تکثیر و باززایی گیاه شمعدانی عطری و همچنین بررسی تنوعهای سوماتیکی احتمالی گیاهان باززایی شده انجام دادهاند. بیشترین میزان تولید نوساقه و ریشه در محیط کشت حاوی ۲ میلیگرم در لیتر BAP و ۱/۰ میلیگرم در لیتر NAA با بکارگیری جدا کشت برگ مشاهده شد. بررسی تنوع سوماتیکی لاینهای باززایی شده اختلافاتی را از نظر شکل برگ و تعداد و نوع کرکهای برگ نسبت به شاهد و همچنین اختلافات ژنتیکی به صورت حذف و اضافه شدن باندها را در الگوی باندینگ DNA نشان داد.
پورجبار و همکاران (۱۳۸۸)، در مطالعهای به عنوان بهینه سازی شرایط درون شیشهای گیاه دارویی ماریتیغال و بررسی تنوع سوماکلونال حاصل با بهره گرفتن از نشانگرهای RAPD به این نتیجه رسیدند که با افزایش میزان هورمونهای توفوردی و کاینتین در محیط کشت، وزنتر و قطر کالوس افزایش یافت. و در هر چهار واکشت کالوسهای رشد یافته در محیط کشت حاوی دو میلیگرم در لیتر کینتین و دو میلیگرم در لیتر۲,۴-D بیشترین وزنتر و قطر کالوس را داشتند.
شعباننژادممقانی و همکاران (۱۳۸۸)،در تحقیقی تنوع سوماکلونال با بهره گرفتن از نشانگرهای پراکسیداز ومیکروستلایت در گیاهEncalyptusmicrothecaF (ازگونههای وارداتی به استانهای جنوبی ایران است)را شناسایی کردند.برای این منظور ریزنمونههای در محیطMS (با نیمی از مقادیرNH₄NO₃ و KNO₃) همراه با سطوح متفاوت هورمونهای,Kin , NAA TDZ کشت گردیدند. تجزیه و تحلیلهای آماری ناپارامتری وجود اثر معنیدار توالی ساده تکرار شونده براللهای پراکسیداز را تایید نمود. بنابر نتایج پایداری مکان ژنی دیمر در مقادیر مختلف TDZ کمتر از مکان ژنی تترامر بود، همچنین همبستگی بیشتری میان اللهای مکان ژنی تترامر و توالیهای ساده تکرار شونده وجود داشت.
تفویضی و همکاران (۱۳۹۰) ، در تحقیقی تغییرات سوماکلونال ایجاد شده در یکی از ارقام پنبه را مورد بررسی قرار دادهاند.در این بررسی هورمون زآتین به میزان(mg/L1/0) به همراه ذغال فعال(mg/L5/0) جهت ساقهزایی در رقم ساحل به کار رفت. از نشانگرهای RAPD برای بررسی تنوع سوماکلونال ایجاد شده در کشت بافت استفاده شد. از میان ۳۰ پرایمر مورداستفاده، ۲۰ پرایمر موفق به ایجاد باند شدند. حضور یا عدم حضور این باندها نشان‌دهنده تغییرات ژنتیکی در گیاهان باززائی شده و فرایند تنوع سوماکلونال میباشند.
شجایی و همکاران (۱۳۹۰)، در این بررسی تنوع ژنتیکی القا شده در کشت بافت گیاهان باززایی شده از سه رقم پنبه تتراپلوئید شامل رقمهای Sindose وMehr و هیبرید آنها Sindose F و Mehr و گیاهان باززایی شده آنها در واکشتهای مختلف بررسی شده است. بذرها روی محیط کشت موراشیگ و اسکوگ بدون هورمون کشت داده شدند و سپس جداکشتهای تک‌‌گرهای روی محیط کشت هورموندار قرار گرفتند. مارکرهایSSR وISSR تعداد متفاوتی از باندها را تولید کردند که نشان دهنده سطوح متفاوت پلیمورفیسم مولکولی در هر ژنوتیپ است. تعدادی از لوکوسهای ISSR/ SSR اختصاصی نیز شناسایی گردید.
تست AMOVA تفاوت معنیداری را برای مارکر ISSR نشان داده است. این مطالعه نشان میدهد که ژنوتیپهای مختلف پنبه از لحاظ میزان تنوع سوماکلونال متفاوت بوده ودرهر ژنوتیپ یک واکشت خاص بالاترین میزان تنوع را به خود اختصاص داده است.
بنیسی و همکاران(۲۰۰۴)، در مطالعهای پایداری ژنتیکی و یکنواختی گیاه رازیانه را مورد بررسی قرار دادند، در این بررسی ابتدا توسط محیط کشت MS حاوی (BA ,NAA) (NAA, KIN) و با بهره گرفتن از ریزنمونههای هیپوکوتیل و ساقه کالوس تهیه شد. سپس این کالوسها باززاشده و از آنها ریشه و ساقه تهیه شد. به مدت ۱۲ ماه در محیط کشت MS حاوی mM 88% ، ۲,۴-D قرار داده شدند سپس از گیاهان باززا شده DNA استخراج شده. در این تحقیق از ۳۰ پرایمر استفاده شد.
بطور کلی تعداد باندها برای هر پرایمر بین ۸ تا ۱۰ عدد متغیر بود. اگر چه بعضی از پرایمرها ۱۶ تا ۱۷ باند تولید کردند. دامنه محصولات چند شکل بین pb 2500-410 بود. همه پرایمرها باندهای مونومورف ایجاد کردند. در این بررسی از روش RFLP نیز استفاده گردید اما هیچ نوع تغییر انحراف یا پلی مورفیسمی در گیاهان ارگانوژنز یا ایمبریوژنز مشاهده نشد.
امینجورآبادی و همکاران (۱۳۹۰)، تنوع ژنتیکی را در گیاه دارویی ماریتیغال با بهره گرفتن از نشانگر ISSR بررسی نمودند. به منظور بررسی تنوع ژنتیکی ۶۱ نمونه ماریتیغال در استان کرمانشاه از نشانگر مولکولی ISSR استفاده گردید. مواد گیاهی مورد مطالعه شامل نمونه های جمعآوری شده از مناطق مختلف استان کرمانشاه بودند از ۶۱ آغازگر ISSR مورد استفاده ۱۹ آغازگر توانستند نوارهای چند شکل ایجاد نمایند. میانگین درصد چند شکلی برابر با ۱۱/۹۳ درصد بود. تجزیه خوشه ای ۶۱ تک بوته را به ۸ گروه تقسیمبندی نمود. نتایج نشان داد که به استفاده از نشانگر ISSR میتوان تنوع ژنتیکی مارتیتغال را مطالعه و نمونه های مختلف را از هم تفکیک نمود.
احسانپور و همکاران(۲۰۰۷) ، بررسی تنوع سوماکلونال در کالوس سیبزمینی توسط تابش UV-C با بهره گرفتن از RAPD-PCR در این تحقیق کالوسها از ساقه و برگهای رشد یافته سیبزمینی در شرایط آزمایشگاهی بدست آمد و از محیط MS حاوی KIN , NAA , 2,4-D و عصاره مخمر استفاده شد. پس از ۳ واکشت، کالوسهای رشد یافته به مدت ۳۰ دقیقه و ۳۰ بار در وقفهای ۲ هفتهای تحت تاثیر تابش UVCبا ML 24/6 مول فوتون M/S قرار گرفتند.
تنوع سوماکلونال ایجاد شده توسط تابش UVCاز ۲۸ پرایمر انتخابی در ۵ مورد مشخص شد و همچنین پرایمر ISSR4 پس از تقویت DNA بارز شد. تابش UVC الگوهای DNA را بصورت منبع واریته ژنتیکی تغییر داد. همچنین از تنوع سوماکلونال می‌توان برای انتخاب کالوسهای سیبزمینی با ویژگیهای مطلوبی مثل مقاومت به تنش شوری و خشکی استفاده کرد.
بهاتیا و همکاران (۲۰۰۵)، تجزیه وتحلیل ژنتیکی کوتیلدون گیاه باززایی شده گوجهفرنگی با بهره گرفتن از شاخصهای AFLP را انجام دادهاند. محیط MS حاوی زآتین mM15 برای تولید ساقه باززایی شده از کوتیلدون مورد استفاده قرار گرفت. نمونه های DNA از ساقه های باززا شده و کوتیلدونهای والدینی برای تجزیه وتحلیل پلیمورفیسم ژنتیکی گیاه گوجهفرنگی که با بهره گرفتن از کشت بافت به دست آمدند استخراج شدند. ۸۵ شاخص با بهره گرفتن از جفت پرایمر CAC/E-ACT M-و M-CTC/E-ACT ایجاد شدند.
انگشت‌نگاری‌های مشخص برای هر جفت پرایمر برای گیاهان باززا شده و مادری ایجاد شدند. شاخص‌های AFLP ابزار ایدهالی برای تجزیه و تحلیل کیفیت ژنتیکی گیاهان باززاشده گوجه فرنگی را به اثبات رساند. این گزارش پیرامون ارزیابی کیفیت ژنتیکی گیاهان والدینی با گیاهان باززاشده از طریق کشت بافت با بهره گرفتن از AFLP محسوب میشود.
پنتارولی و کامادرو(۲۰۰۵)، در این تحقیق تنوع سوماکلونال در گیاه باززایی شدهofficinalisL Asparagus (مارچوبه) از طریق کشت طولانی مدت بافت کالوس بررسی شد. تنوع سوماکلونال در گیاه باززایی شده از طریق کشت طولانی مدت بافت کالوس از دوژنوتیپ دیپلوئید Asparagus که توسط آن تغییر در فنوتیپ گیاه- رفتار جهشی- پلوئیدی بودن- ماندگاریهاگ با طرحهای AFLP مشخص شدند. تغییرات فنوتیپی در رنگ برگها- اندازه گل- ساختار گل شناسایی شدند. نتایج نشان میدهند که گیاهان ایجاد شده از تنوع سوماکلونال در شرایط درون شیشهایی تغییر مشخص را نشان میدهند که میتوانند برای سیستمهای انتخاب بهرهبرداری شود.
بارنس و همکاران(۲۰۰۳)، در این تحقیق با بهره گرفتن از MSAP , SD-AFLP ارزیابی متیلاسیون CCGG در ژنوم موز را بررسی کردند. این تحقیق شامل ۱۸ جفت پرایمر بود و مشخص کرد در ژنوم موز، %۸۰ از مکانهای CCGG متیلاسیون نشده و %۵ در سیتوزین داخلی متیلاسیون شدند و ۱۵ درصد در سیتوزینهای خارجی متیلاسیون شدند.
نگزاهایو و همکاران (۲۰۰۷)، تنوع سوماکلونال در سطح زنجیرهی نوکلوتیدی در برنج را بررسی نمودند. ابتدا تنوع ژنتیکی با بهره گرفتن از ۲ مارکر مولکولیISSR و RAPD مورد بررسی قرار گرفت. باندهای ایجاد شده تنوع ژنتیکی را نشان دادند. بعلاوه فعالیت ترنسپوزونها و تغییر موقعیتی MITE توسط لوکوسهای PCR مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. دراین آزمایش مشخص شد، متیلاسیون DNA نقش مهمی را در تنوع سوماکلونال ایفا کرد. سلولها توسط عامل شیمیایی آزاستیدین۵ مورد تیمار قرار گرفتند. که متیلاسیون سیتوزین را با متوقف کردن فعالیت متیل ترانسفراز DNA کاهش میدهد. و تنها افزایش جزئی در میزان تنوع سوماکلونال در گیاهان باززا شده ایجاد شد. ISSR محاسبه و نشان داد که مجموعه های تحت آزمایش آزاسیتیدین ۵ به دو مجموعه مجزا تقسیم شده که نشان دهنده تاثیر غیرمستقیم آزمایش تنوع ژنتیکی است که به تیمار آزاسیتیدین وابسته است.
شیدایی و همکاران(۲۰۰۸)، تنوع سوماکلونال در موز را با بهره گرفتن از مارکر RAPD بررسی کردند. ۳۰ پرایمر RAPD برای بررسی تنوع سوماکلونال بین گیاهان والدینی وگیاهان باززا شده در اولین – سومین – پنجمین – هفتمین و نهمین واکشت مورد استفاده قرارگرفتند. ۱۸ مورد از ۳۰ پرایمر ۲۸۹ باند را در همه ژنوتیپهای مورد تحقیق تولید کردند. ۱۴۲ باند (% ۹۵/۴۸) پلیمورفیسم در ژنوتیپهای والدینی ایجاد شدند در حالیکه در گیاهان باززایی شده ۱۴۷ باند پلیمورف بودند (% ۴۰/۵۱) از میان پرایمرهای مورد استفاده OP1-07 بیشترین تعداد باندها را تولید کرد. در حالیکه پرایمر ۱۶-OPH کمترین تعداد(۵) باند را تولید کرد. مشاهده باندها در ژنوتیپهای والدینی و آسیب آن در گیاهان باززایی شده در واکشتهای مختلف مشخص شد، آسیب به محل باندها درگیاهان باززاشده از طریق کشت بافت بدلیل تنوع سوماکلونال صورت گرفته است. به نظر می‌رسد که تغییرات ژنتیکی افزایش یافته در گیاهان باززایی شده با دوره زمانی واکشتها افزایش مییابد.
خودامزاده و همکاران(۲۰۱۰)، تشخیص تنوع سوماکلونال با بهره گرفتن از نشانگر RAPD از طریق ریزازدیادی در گیاه ارکیده را انجام دادهاند. Protocorm-like bodies (PLBS ) تولید شده از برگ گیاه ارکیده در محیط ۲/۱ MS کشت داده شدند و توسط ۲ واکشت در مدت ۳ ماه تکثیر شدند. از ۱۲ پرایمر(RAPD) برای تشخیص پلیمورفیسم بین گیاه مادری و تنوع سوماکلونال ایجاد شده از تکثیر PLBSهای کشت شده استفاده شد. ۸ مورد از ۱۱ پرایمر موجب تولید ۱۷۲ باند با ۱۸ باند پلیمورفیسم در همه آزمایشات شدند محصولات تولید شده بین ۱۲۵ تا bp 8000 متفاوت بودند. از میان پرایمرهای بکار رفته P16 بالاترین تعداد باندها (۲۹) را تولید کرد در حالیکه پرایمر opu10 کمترین تعداد را تولید کرد(۱۵). مجموعه ضریب شباهت از ۸۳/۰ تا ۱/۰ در میان واکشتهای مختلف و گیاه مادر(MP) متفاوت بود. مشخص شد تغییرات جزئی یا عدم تغییر بین PLBS , MP ایجاد شده پس از ۳ ماه تولید روی داد.
فصل سوم
مواد و روش‌ها
۳-۱- آزمایش اول
این آزمایش به منظور بررسی تاثیر تیمارهای هورمونی و نوع ریزنمونه بر کالزایی در گیاه بارهنگ صورت گرفت.
۳-۱-۱- مواد گیاهی
ریزنمونههای مورد استفاده در این بخش شامل ریشه و برگ گیاه بارهنگ بود که از گیاهچههای حاصل از کشت بذر این گیاه بدست آمد.
۳-۱-۲- محیط کشت
محیط کشت مورد استفاده در این تحقیق محیط پایه MS (جدول۳-۱) بود که بر اساس دستورالعمل مندرج در (جدول ۳-۲) تهیه گردید و با ۷ گرم آگار به ازای هر لیتر بصورت جامد درآمد. با توجه به اینکه تعیین بهترین ترکیب هورمونی یکی از اهداف بهینه سازی محیط کشت برای تولید کالوس بود، در فاز کالزائی محیط پایه MS در پنج ترکیب هورمونی مختلف متشکل از هورمونهای ۲,۴-D،KIN،IAA (جدول ۳-۸) ساخته شد.
جدول ۳-۱: ترکیبات معدنی محیط پایه MS کامل