۴۴۰/۰ml
۲۲۰/۰ml
اکریل آمید ۴۰%
—–
——
بافر تریس ۲ مولار ۸/۸
۴۸۰/۰ml
۲۴۰/۰ml
بافر تریس ۵/۰ مولار ۸/۶
۷۲۰/۲ml
۳۶۰/۱ml
اوره ۹ مولار
۳۳۰/۰ml
۱۶۵/۰ml
آب مقطر
۳۰ μl
۱۵ μl
APS %۱۰
۴ μl
۲ μl
TEMED
۲-۱۳-۳- آماده‌سازی نمونه‌ها
۱) به تعداد نمونه‌هایی که با شتاب g3000 سانتریفوژ شده، ویال ۵/۰ میلی‌لیتری برداشته و شماره گذاری گردید.
۲) از مایع رویی ویال‌های سانتریفوژ شده، ۵۰ میکرولیتر نمونه داخل ویال ۵/۰ ریخته شد.
۳) در یک ویال دیگر ۳۰۰ میکرولیتر از بافر نمونه مخلوط گردید و از این ویال ۲۵ میکرولیتر به ویال‌های حاوی مایع رویی اضافه شد.
۴) همگی ویال‌ها ورتکس شده و ۵ دقیقه در آب جوش نگه داشته می‌شوند.
۵) از BLG طبیعی نوع A به عنوان شاهد استفاده شد. به منظور آماده کردن نمونه شاهد، ۱ میلی‌گرم از بتالاکتوگلوبولین توزین شده و در داخل ویال ریخته و با آب مقطر به حجم ۱ میلی‌لیتر رسانده شد. از این نمونه هم ۵۰ میکرولیتر برداشته و با ۲۵ میکرولیتر بافر نمونه آماده شده در مرحله ۳ مخلوط گردید. ورتکس و ۵ دقیقه نگه داری در آب جوش برای این نمونه نیز انجام شد.
۶) سپس با میکروپیپت ۳۰ میکرولیتر از هر ویال را در داخل چاهک می‌ریزیم. باید دقت شود که محتوای هر چاهک وارد چاهک دیگر نشود و نمونه‌ها به گونه‌ای تزریق شود که خوب در چاهک ها بنشیند.
۷) سپس منبع برق را روشن کرده و جریان را به ازای هر ژل در قسمت پشته سازی ۱۰ میلی‌آمپر و در قسمت تفکیک کننده ۲۰ میلی‌آمپر تنظیم شد و ولتاژ را روی ۱۰۰ تنظیم گردید.
۸)در حدود ۵/۱ ساعت زمان می‌برد تا نمونه‌ها مهاجرت کنند و به انتهای کاست برسند. هنگامی که رنگ آبی به انتهای کاست رسید جریان قطع می‌گردد.
۲-۱۴- آزمون ضدباکتریایی
۲-۱۴-۱- تهیه کدورت نیم مک‌فارلند
۱)۵/۰ میلی لیتر از کلرور باریوم (BaCl2) به ۵/۹۹ میلی لیتر اسید سولفوریک اضافه شد و با هم زدن مداوم سوسپانسیون بدست آمد .
۲)چگالی صحیح کدورت استاندارد با بهره گرفتن از اندازه گیری جذب در اسپکتروفتومتر با طول مسیر نوری یک سانتی متر ، مشخص شد. جذب در nm625 باید بین ۰۸/۰ تا ۱۳/۰ باشد .
۳)سوسپانسیون سولفات باریوم به مقدار ۴ تا ۶ میلی متر در لوله های درپیچ دار هم اندازه با لوله های سوسپانسیون باکتریایی ریخته شد .
