۵’-GACTGCGTACGAATTCTGC-3′

Reverse

EM2

۵’-GACTGCGTACGAATTCGCC-3′

Reverse

EM18

۵’-GACTGCGTACGAATTCTCA-3′

Reverse

EM19

۵’-GACTGCGTACGAATTCTCC-3′

Reverse

EM20

تعداد ۱۳ آغازگر از دسته آغازگرهای شرکت سیناژن مورد استفاده قرار گرفت (جدول۲-۴) این آغازگرها به صورت خشک فریز شده خریداری شدند که با آب دیونیزه استریل به غلظت pmol100 رقیق شده و در مقادیر کمتر در فریزر نگهداری شدند.
شکل۲-۴ دستگاه ترمو سایکلر مدل verity 96 well Thermal Cycler

۲-۶ الکتروفورز:

الکتروفورز یک روش آزمایشگاهی برای جداسازی مولکول های DNA و پروتئین است. برای انجام این روش از دستگاهی به نام دستگاه الکتروفورز (شکل۲-۵) استفاده می شود. تنوع زیادی در بین دستگاه های الکتروفورز وجود دارد، ولی هر دستگاه الکتروفورزی دارای اجزای میدان الکتریکی، منبع تغذیه و محیط تفکیک می باشد. وقتی مخلوطی از ذرات باردار در یک محیط الکتروفورزی قرار می گیرند، هر ذره باردار با یک سرعت خاص حرکت می کند و میزان حرکت هر ذره به قدرت میدان الکتریکی، اندازه، شارژ خالص ذره و نوع محیط هادی وابسته است. عمده ترین محیط های هادی مورد استفاده در سیستم الکتروفورز ژل آگارز، اکریلامید و نشاسته هستند. در منافذ این ژل ها بافر قرار می گیرد تا جریان الکتریکی هدایت شود و مولکول ها به راحتی مهاجرت کنند. این ژل ها در شکل ها، اندازه ها و همچنین تعداد منافذ مختلف قابل ریختن هستند. انتخاب این شاخص به طور عمده به اندازه قطعاتی که قرار است در سیستم الکتروفورزی از همدیگر تفکیک شوند، وابسته است. در محیط الکتروفورزی مولکول های مشابه باسرعت مشابه حرکت می کنند و پس از مدتی در یک نقطه متمرکز می شوند ویک باند یا نوار تشکیل می دهند. بدین ترتیب می توان مولکول های مختلف را از همدیگر جدا کرد (۳).

شکل ۲-۵ دستگاه الکتروفورز

۲-۶-۱ محلول اتیدیوم بروماید

اتیدیوم بروماید با فرمولBr3N20H21C و وزن مولکولی ۴/۳۹۴ گرم بر مول (شکل۲-۶) به عنوان یک نشان غیر رادیواکتیوبرای تشخیص و دیدن باندهای اسید نوکلئیک در الکتروفورز و در روش جداسازی اسیدنوکلئیک ها بر اساس ژل استــفاده می­ شود. اتیدیوم بروماید یک ماده قرمز تیره، کریستالی، جامد، غیر فرار، به طور متوسـط محلول در آب، که دارای خاصیــت فلورسنس و رنگ قهوه ای مایل به قرمز در هنگام قرار گرفتن در معرض اشعه UV می باشد. اگر چه یک ابزار مناســبی جهت تحقیق می باشد ولی به خاطر خصوصیات خطرناک آن، بایستی در هنگام جابجایی و دفع به نکات ایمنی و بهداشتی آن توجه نمود .اتیدیوم بروماید یک موتاژن قوی با خاصیت سمی متوسط بعد از یک تماس حاد است. اتیدیوم بروماید می ­تواند از طریق پوست جذب فوری شود، بنـابراین ممانعت از تماس با این ماده شیـمیایی بسیـار مهم می باشــد. این ماده همچنین محرک پوست، چشم، بینی و دستگاه فوقانی می باشد. یک محلول پایه با غلظت ۱۰ میلی گرم بر میلی لیتر تهیه شده و با غلظت ۱میکروگرم بر میلی لیتر مورد استـفاده قرار میگیــرد. ژلــها پس از الکتــروفورز در ظرف جداگانه ای که حاوی محلول اتیدیوم بروماید است، قرار گرفته و پس از شستشو با آب مقطر، آماده عکسبرداری میگردند (۱۲).

شکل ۲-۶ ساختار اتیدیوم بروماید

۲-۶-۲ تهیه ژل الکتروفورز

برای انجام الکتروفورز محصولات حاصل از PCR در این تحقیق، از ژل آگارز ۳درصد استفاده گردید. برای تهیه ژل، ۶گرم آگارز به همراه ۲۰۰ میلی لیتر بافر TBE 10X در شیشه ریخته شده سپس مواد در مایکروفر حرارت داده شدند تا مایع شفافی به دست آید. محلول در دمای اتاق قرار داده شده تا خنک شود، سپس ۸ میکرولیتر اتیدیوم بروماید به محلول افزوده شد. سینی الکتروفورز افقی از دو طرف با اسفنج محکم شد و برروی یک سطح تراز قرار داده شد و محلول با دقت بدون ایجاد هرگونه حبابی در ژل در سینی ریخته شد، سپس شانه های مخصوص سینی در محل خود قرار داده شدند. پس از بسته شدن کامل ژل، اسفنج های اطراف سینی برداشته شده و شانه ها با احتیاط از ژل خارج شدند و سینی به همراه ژل در بافر X TBE 5/0 در دستگاه الکتروفورز افقی قرار داده شد، به صورتی که ژل نیم سانتی متر در بافر فرو رود. قابل توجه است که بـرای تهیه ژل و انجام الکتروفورز نیازمند به بـافر ( X5/0) اسـت. بـرای تهیه cc 1000 بافـر (X5/0) میزان cc50 از بافر TBE X10 را بوسیله آب دیونیزه به حجم cc1000رسانده شد(۳).

۲-۶-۳ الکتروفورز محصول PCR

به هر تیوپ DNA حاصل از PCR، ۳ میکرولیتر بافر بارگذاری اضافه گردید، سپس از هر نمونه ۱۲میکرولیتر در هر چاهک تزریق شد. پس از اینکه تک تک نمونه ها در چاهک ها قرار گرفتند، در چاهک اولی یا آخری ۲ میکرولیتر از DNA ladder (100bp Plus) که از شرکت سیناژن تهیه شد، قرار داده شد. الکتروفورز با ولتاژ ۵۰ ولت بر سانتی متر و به مدت ۵ ساعت انجام گرفت. سپس ژل از دستگاه خارج شد و در زیر نور ماوراء بنفش (UV) در دستگاه Gel Logic 212 pro Imaging system (Caresteam, USA) باندها مشاهده شدند و عکس برداری انجام گرفت(شکل۲-۷).

شکل۲-۷ دستگاه ژل داک

۲-۷ تجزیه و تحلیل داده ها:

استفاده از روش نشانگرهای مولکولی مبتنی بر DNA جهت بررسی تنوع ژنتیکی، منجر به تولید حجم عظیمی از داده ها می­ شود. روش های آماری چند متغیره تکنیکی مناسـب جهت تجزیه وتحلیل و مدیریـت این داده ها می باشد، که از بیــن این روش ها تجزیه کلاستر و تجزیه به مختصات اصلی جهت گروه بندی نمونه ها به وفور استفاده می شوند. در هنگام استفاده از نشانگرهای مولکولی، صفات مورد بررسی در واقع باندهایی می باشند که با یک آغازگرتولید می شوندحضور باند با عدد یک و عدم حضور باند باعدد صفر نشان داده می شود. برای تجزیه داده ها از دیدگاه بررسی تنوع ژنتیکی در این نشانگر ماتریس صفر و یک تشکیل می شود.
آنالیز خوشه­ای با بهره گرفتن از نرم­افزار POPGEN32 انجام گرفت. دندروگرام ژنوتیپ­ها بر اساس روش UPGMA بدست آمد. تشابه ژنتیکی بین ژنوتیپ­ها با بهره گرفتن از ضریب تشابه Nei محاسبه شد(۵۸).
فصل سوم:
نتایج و بحث

۳-۱ پلی­مورفیسم

در این پروژه از ۱۶ ترکیب پرایمری SRAP استفاده شد، از میان آنها ۱۱ ترکیب که نسبت به سایرین چندشکلی قابل توجهی را نشان دادند و دارای باندهای تکرارپذیر و واضح بودند، انتخاب شدند. ۵ ترکیب پرایمری ME4-EM6 ، ME3-EM4، ME8-EM18، ME8-EM19 و ME8-EM20 در برخی جمعیت­ها وضوح و قابلیت تکرار کافی را نداشتند بنابراین کنار گذاشته شدند. همه ۱۱ جفت پرایمر به کار برده شده با موفقیت باندهای قابل تفسیر و خوانا برای گونه­ موردنظر ایجاد کردند. برای نمونه یکی از الگوهای باندی به­دست­آمده از محصولات PCR به وسیله یکی از آغازگرهای SRAP در شکل­ ۳-۱ نشان داده شده است. این شکل به وضوح وجود چندشکلی در DNA بین­جمعیتی با توجه به هر نمونه برای پرایمر را نشان می­دهد. برای پی بردن به تنوع بین جمعیت­ها با بهره گرفتن از محاسبات آماری و تبدیل داده ­ها از روی پروفیل باندی حاصل براساس هر آغازگر، کدگذاری به صورت (۱) برای حضور باند و (۰) برای عدم حضور باند، صورت گرفت که در جدول­­های۳-۱ نمونه ­ای از نتایج نشان داده شده است.

شکل ۳-۱ الگوی باندی قطعات تکثیر شده برای جفت آغازگر Me2-Em2 به ترتیب از چپ به راست برای نمونه های A1 تا B5

جدول ۳-۱ نتایج کد گذاری آغازگر Me2-Em2 برای همه جمعیت­ها