۳-۹ اندازه گیری کلروفیل برگ: ( روش آرنون^[۹۷] ، ۱۹۶۷)
میزان کلروفیل کل، کلروفیل a و b با نمونه گیری از ماده تر گیاهی اندازه گیری خواهد شد
مقدار ۲۵/. گرم از ماده تر گیاهی در هاون چینی به خوبی له می گردد
۱۰ میلی لیتر استن ۸۰% به نمونه اضافه، سپس در دستگاه سانتریفیوژ با سرعت ۴۰۰۰ دور در دقیقه قرار دهید. عصاره جدا شده فوقانی حاصل از سانتریفیوژ را به بالن شیشه ای منتقل می شود.
مقداری از نمونه داخل بالن را به کووت اسپکتروفتومتر ریخته و سپس به طور جداگانه در طول موج های ۶۶۳ نانومتر برای کلروفیل a ، و ۶۴۵ نانومتر برای کلروفیل b توسط اسپکتروفتومتر مقدار جذب قرائت می شود. شاهد استن ۸۰% است.

در نهایت با بهره گرفتن از فرمول زیر غلظت کلروفیل محاسبه می شود.
کلروفیل کل (گرم در لیتر) = (OD 663 × ۰۰۸۰۲/۰) + (OD 645× ۰۲۰۲/۰)
کلروفیل a (گرم در لیتر) = ( OD663 × ۰۱۲۷/۰) – ( OD645 × ۰۰۲۶۹۰/۰)
کلروفیل b (گرم در لیتر) =( OD663 × ۰۰۴۶۸/۰) – ( OD645 × ۰۲۲۹۰/۰)
که در روابط فوق ۶۶۳OD و ۶۴۵ OD به ترتیب میزان جذب در طول موج های ۶۶۳ و ۶۴۵ نانومتر می باشد.

شکل (۳-۸): جداسازی کلروفیل با بهره گرفتن از استون
شکل (۳-۷): عصاره جدا شده حاصل از سانتریفیوژ
۳-۱۰ اندازه گیری پرولین برگ (روش بتس^[۹۸] و همکاران، ۱۹۷۳)
آماده سازی محلول:
اسید فسفریک ۶ مولار: ۱۲/۴۱ میلی لیتر اسید فسفریک ۸۵% با دانسیته ۶۸/۱ کیلو گرم در لیتر به آب مقطر اضافه شد و سپس به حجم ۱۰۰ میلی لیتر رسانده شد.
سولفوسالیسیلیک اسید ۳%: ۳ گرم پودر سولفوسالیسیک اسید در آب مقطر حل شد و به حجم ۱۰۰ میلی لیتر رسانده شد.
اسیدناین هیدرین: ۲۵/۱ گرم پودر اسید ناین هیدرین در ۳۰ میلی لیتر اسید استیک گلاسیال حل شد و سپس ۲۰ میلی لیتر اسید فسفریک ۶ مولار آماده شده و به آن اضافه گردید.
استاندارد ۱۰۰ میلی گرم بر لیتر پرولین: ۰۱/۰ گرم پرولین در آب مقطر حل شد م به حجم ۱۰۰ میلی لیتر رسانده شد.
استانداردهای ۰، ۴، ۸، ۱۲، ۱۶ و ۲۰ میلی گرم بر لیتر پرولین: به ترتیب ۰، ۴، ۶، ۸ و ۱۰ میلی لیتر از استانداردهای ۱۰۰ میلی گرم در لیتر پرولین برداشته شد و با آب مقطر به حجم ۱۰۰ میلی گرم بر لیتر رسانده شد.
تولوئن
روش کار:
۵/۰ گرم ماده تر گیاهی با هاون خرد و درون لوله آزمایش ریخته شد، سپس ۱۰ میلی لیتر سولفوسالیسیک اسید ۳% اماده شده به لوله ها اضافه شد .
نمونه ها در ۱۵۰۰۰ دور به مدت ۱۰ تا ۱۵ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی گراد سانتریفوژ شدند تا مواد اضافی از محلول جدا شوند.
مقدار ۲ میلی لیتر از عصاره صاف شده درون تیوپ جدید ریخته شد و ۲ میلی لیتر اسیدناین هیدرین و ۲ میلی لیتر اسید استیک گلاسیال به آن افزوده و خوب مخلوط شد.
هم زمان مقدار ۲ میلی لیتر از محلول ۰، ۴، ۸، ۱۲، ۱۶ و ۲۰ میلی گرم بر لیتر پرولین درون تیوپ های جدید ریخته شد و ۲ میلی لیتر اسیدناین هیدرین و ۲ میلی لیتر اسیداستیک گلاسیال به آن ها افزوده و سپس خوب مخلوط شد ودر حمام بن ماری گذاشته شد.
نمونه ها به مدت ۱ساعت در حمام بن ماری حرارت داده شد
مقدار ۴ میلی لیتر تولوئن به محلول اضافه شد وبه مدت ۲۰ ثانیه با دستگاه ورتکس به هم زده شد.
پس ازآن محلول به صورت جدا در می آید ۴میلی لیتر روی محلول را با سرنگ کشیده درون دستگاه اسپکتروفتومتر قرار داده عدد قرائت شده میزان پرولین می باشد.
شکل (۳-۹): جداسازی محلول با بهره گرفتن از دستگاه سانتریفیوژ
۳-۱۱ اندازه گیری میزان قند برگ (روش فنل و اسید سولفوریک^[۹۹])
حدود ۱/۰ گرم از هر گلدان: بافتش را وزن کرده( وزن ان نباید از ۱۵/۰ گرم بیشتر باشد)
در این بافتها برگ سبز مد نظر است. سپس داخل لوله آزمایش شسته شده با آب مقطر و بعضآ استریل شده با اتوکلاو قرار می دهیم سپس به هر نمونه ۱۰سی سی الکل اتانول اضافه می کنیم و سر آن را چسب می پوشانیم که الکل نپرد نمونه ها را در یخچال نگهداری می کنیم تا مرحله بعد.
۱/۰ گرم بافت سبز + ۱۰سی سی الکل اتانول = محلولی که سبز رنگ است
سپس نمونه ها را در بن ماری به مدت نیم ساعت و در دمای ۶۰ درجه قرار می دهیم.
۱سی سی از محلول سبز رنگ بدست امده + ۱سی سی فنل (درست شده از ۱ گرم فنل که در ۲۰۰ سی سی اب مقطر به حجم رسانده می شود) +۵ سی سی اسید سولفوریک (حتمآ به آرامی در لوله ها ریخته شود) (۹۵%- ۹۸%)
سپس محلول بدست آمده را پس از سرد شدن در داخل کووت ریخته و در دستگاه اسپکتروفتومتر قرار داده و در طول موج ۴۸۳ نانومتر اعداد را قرائت کرده و پس از هر دفعه استفاده از کووت آنرا با آب مقطر شسته و خشک می کنیم
قبل از استفاده دستگاه اسپکتروفتومترآانرا با محلول blank به عنوان شاهد صفر می کنیم
Blank = 1 سی سی الکل اتانول + ۱ سی سی فنل + ۵ سی سی اسید سولفوریک ( قهوه ای عسلی)
نکته : دو فاز رنگی اسید سولفوریک را به آرامی تکان داده تا مخلوط شود مدتی صبر نموده تا محلول سرد شده سپس اقدام قرائت نمونه ها می کنیم
شکل (۳-۱۰): دو فاز رنگی فنول و اسید سولفوریک در اندازه گیری قند گیاه
۳-۱۲ رنگبری، رنگ آمیزی و تعیین کلونیزاسیون ریشه ها :
ریشه های نمونه برداری شده با آب بخوبی شسته شدند، بطوریکه تمامی خاک و باقیمانده گیاهی از ریشه ها حذف گردیدند. بعد از نمونه برداری از ریشه های شسته شده، ریشه ها بداخل ظروف شیشه ای شفاف به حجم ۵۰ میلی لیتر منتقل شدند. سپس محلول KOH 10% به ریشه ها اضافه شده و در درجه حرارت اتاق بمدت ۵-۳ روز نگهداری شدند (مدت زمان نگهداری در محلول KOH به قطر ریشه ها بستگی دارد). جهت خنثی کردن محیط قلیائی ریشه های رنگبری شده حاصل از روش قبل، ریشه ها با آب مقطر شسته شده و بمدت ۲-۱ دقیقه در محلول HCL 1 مولار قرار داده شدند.
جهت رنگ آمیزی ریشه ها از روش تغییر یافته فیلیپس^[۱۰۰] و هایمن، (۱۹۷۰) استفاده گردید. در این روش ریشه های رنگبری شده بمدت ۱۲-۶ ساعت در محلول رنگ آمیزی Trypan blue 01/0% در درجه حرارت اتاق نگهداری شدند. ریشه ها پس از خارج کردن از محلول رنگ و شستشو با آب مقطر اماده تعیین میزان کلونیزاسیون بودند. برای نگهداری ریشه ها تا زمان اندازه گیری میزان کلونیزاسیون از محلول اسید لاکتیک، گلیسرول و آب استفاده گردید.
برای تعیین میزان کلونیزاسیون قارچ میکوریزا با ریشه گیاهان مورد بررسی از روش جیووانتی و موس،(۱۹۸۰) استفاده گردید. بر اساس این روش ریشه های رنگ آمیزی شده به قطعات یک سانتیمتری تقسیم شده و در سطح یک پتری دیش مشبک پخش گردیدند. سپس با بهره گرفتن از میکروسکوپ با بزرگنمائی ۴۰ تعداد برخورد
هر یک از اندام قارچی( شامل ریسه، ارباسکول، کویل و وزیکل) با خطوط شبکه پتری دیش شمارش و بر حسب درصد محاسبه گردید.
شکل (۳-۱۱): مراحل رنگبری، رنگ آمیزی و تعیین کلونیزاسیون ریشه ها
۳-۱۳ تجزیه وتحلیل آماری داده ها :