فصل سوم
مواد و روش­ها
فصل سوم:
مواد و روش­ها
3-1 محل اجرای آزمایش
این تحقیق در سال تحصیلی 94-1393 در دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی رامین خوزستان، دانشکده علوم دامی وصنایع غذایی در آزمایشگاه مرکزی انجام شد.
3-2 مراحل تحقیق
مراحل انجام این پژوهش به شرح زیر می­باشد:

1. 1. تهیه­نمونه­های خون از مرغ­های بومی مرکز مرغ بومی استان خوزستان (شرکت نهاده­های دامی جاهد- مرکز تولید مواد ژنتیکی دام).

1. 1. استخراج دی. اِن. اِی از نمونه­های خون جمع آوری شده از 100 قطعه مرغ بومی خوزستان.

1. 1. تعیین کمیت و کیفیت دی. اِن. اِی استخراج شده.

1. 1. انتخاب جایگاه مورد نظر با توجه به مقالات گزارش شده و خرید آن­ها از شرکت تکاپوزیست.

1. 1. رقیق نمودن پرایمرها و بهینه­سازی واکنش.

1. 1. انجام واکنش پی. سی. آر نمونه­های مورد نظر.

1. 1. الکتروفورز نمونه­های پی. سی. آر.

1. 1. افزودن آنزیم به محصولات پی. سی. آر.

1. 1. الکتروفورز محصولات هضم شده.

1. 1. انجام محاسبات به کمک نرم­افزارهای مناسب و گزارش نتایج و تفسیر داده ­ها.

3-3 جمع آوری نمونه­های خون از جمعیت مورد نظر
در این آزمایش از 100 قطعه مرغ بومی به صورت کاملاً تصادفی از مرکز مرغ بومی استان خوزستان (شرکت نهاده­های دامی جاهد- مرکز تولید مواد ژنتیکی دام) خون گیری صورت گرفت. خون گیری از ورید بال به میزان 3-4 سی سی در لوله­های خلاء­ دار حاوی ماده ضد انعقاد EDTAانجام گرفت. پس از اتمام خون­گیری نمونه­ها در ظرف حاوی یخ به آزمایشگاه منتقل شده و تا زمان انجام آزمایشات در فریزر با دمای 20- درجه سانتی ­گراد نگهداری شدند.
3-4 استخراج دی. اِن. اِی
استخراج دی. اِن. اِی پس از تغییر و بهینه­سازی روش استخراج نمکی (میلر و همکاران^[96]، 1998) انجام گرفت. به سبب برتری­های زیر روش استخراج نمکی به استخراج با بهره گرفتن از کیت انتخاب شد:

1. 1. حجم بالای دی. اِن. اِی استخراج شده

1. 1. هزینه­ خیلی کمتر از کیت

البته با توجه به امکانات و شرایط آزمایشگاهی تغییراتی در روش اصلی استخراج نمکی داده شد. در استخراج دی. اِن. اِ با مشکل غلظت بالای خون طیور برخورد کردیم برای اینکه گلبول­های قرمز خون پرندگان دارای هسته می­باشد و نیز گلبول قرمز آن­ها بزرگتر از پستانداران است، در کل خون پرندگان غلیظ­تر می­باشد و این موضوع ما را در استخراج دی. اِن. اِ با مشکل رو به رو کرد. برای مرتفع کردن این مسئله ما مقدار کمتری از حجم خون را برای استخراج دی. اِن. اِ به کار بردیم (به جای 3 الی 5 سی سی خون 5/1 تا 2 سیسی خون برای استخراج مورد استفاده قرار گرفت).

3-4-1 بافرهای مورد نیاز در استخراج دی. اِن. اِی

1. 1. بافر جدا کننده

MgCl₂ (5mM), Sucrose (0.32M), TritonX- 100 1%, Tris- HCl (10mM) PH= 7.5

1. 1. بافر لیز کننده^[97] هسته

NaCl (400mM), Na₂ EDTA (2mM), Tris – HCl (10Mm) PH=8.2

1. 1. بافر TE

Tris – HCl (10Mm) PH 7.5, Na₂ EDTA (.02Mm)

1. 1. بافر پروتئیناز k

Tris – HCl (10Mm), EDTA (5Mm), SDS (.05%)
3-4-2 مراحل استخراج دی. اِن. اِی
مرحله اول: مقدار 5/1 تا 2 سی سی خون کامل را که حاوی ماده ضد­انعقاد بود، داخل لوله­های پلاستیکی 15 میلی­لیتر موسوم به فالکون ریخته شد.
مرحله دوم: دو برابر حجم خون، بافر جداکننده اضافه و سپس ورتکس شد^[98] تا دیواره گلبول­ها پاره شده و خون به رنگ قرمز روشن درآمد. جهت جلوگیری از شکستن دی. اِن. اِی زمان ورتکس کاهش یافت (به جای 10 دقیقه ورتکس حدود 10 الی 15 ثانیه ورتکس گردید).