شکل ۴-۱۱- مطالعه ی اتصال کنگورد به نمونه های مختلف انسولینی.
نمودار A و B به ترتیب مربوط به نمونه های انسولین انکوبه شده با آسپیرین برای ۲۰ و ۳۶ روز می باشد. در این مطالعه غلظت کنگورد ۱۰ میکرومولار و غلظت انسولین ۱۵/۰ میلی گرم در میلی لیتر بود. نمودار داخلی طیف افتراقی بین طیف جذبی کنگورد تنها و طیف جذبی کنگورد با پروتئین را نشان می دهد. حروف F، N، Ac و CR به ترتیب معرف جذب نمونه های انسولین تازه تهیه شده، انسولین انکوبه در عدم حضور آسپیرین، انسولین انکوبه در حضور آسپیرین و جذب رنگ کنگورد به تنهایی است.

۴-۱۰- مطالعه ی میکروسکوپی تشکیل فیبر آمیلوئیدی به وسیله ی پروتئین انسولین در حضور آسپیرین
فیبر آمیلوئیدی پروتئین متشکل از ساختار های بتا می باشد. یکی از پروب های مفید برای شناسایی فیبر آمیلوئید پروتئین، پروب فلورسانس تیوفلاوین T است. تیوفلاوین T ضمن اتصال به ساختار های بتا در فیبر آمیلوئید با تهییج در طول موج ۴۵۰ نانومتر دارای نشر فلورسانس در طول موج ۴۸۵ نانومتر می باشد (Ban و همکاران ۲۰۰۳). از این خاصیت تیوفلاوین T می توان برای مشاهده ی فیبر آمیلوئید پروتئین با میکروسکوپ فلورسانس بهره برد. در این مطالعه اسلاید مربوط به نمونه های مختلف انسولینی که به مدت ۲۰ دقیقه با غلظت ۲۰ میکرومولار تیوفلاوین T در تاریکی و در دمای اتاق انکوبه شده بود با فیلتر آبی میکروسکوپ فلورسانس مشاهده شد. تصویرهای میکروسکوپی گرفته شده از نمونه های انسولین تازه تهیه شده، طبیعی و استیله در شکل ۴-۱۲ مشاهده می شود. در نمونه های انسولین تازه هیچگونه ساختار فیبری وجود ندارد. در تصویر نمونه های انسولین استیله و غیر استیله ساختار فیبری در اثر اتصال تیوفلاوین T به آن ها قابل رویت می باشد که این ساختار فیبری در نمونه ی انسولین استیله به مراتب بیشتر است. تصاویر میکروسکوپی به خوبی نشان می دهد که آسپیرین در مدت زمان ۳۶ روز با ایجاد تغییرات ساختاری و غنی کردن پروتئین انسولین از صفحات بتا باعث تشکیل فیبر آمیلوئیدی در این پروتئین شده است.

شکل ۴-۱۲- تصویر فیبر آمیلوئیدی پروتئین انسولین مشاهده شده با فلورسانس تیوفلاوین T.
پروتئین انسولین در حضور و عدم حضور غلظت ۱۵ میلی مولار آسپیرین به مدت ۳۶ روز در بافر فسفات ۱۰۰ میلی مولار با ۴/۷pH در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه شد. بعد از اتمام زمان انکوباسیون نمونه های پروتئینی سانتریفیوژ شد. سپس غلظت ۵/۱ میلی گرم در میلی لیتر نمونه های مختلف انسولینی با غلظت ۲۰ میکرومولار تیوفلاوین T به مدت ۲۰ دقیقه انکوبه شد. ساختارهای فیبری در نمونه های پروتئینی با فیلتر آبی میکروسکوپ فلورسانس به رنگ زرد نمایان می شود. A) نمونه های انسولین تازه تهیه شده، B) انسولین انکوبه شده در غیاب آسپیرین، C) انسولین انکوبه شده در حضور آسپیرین.
۴-۱۱- مطالعه ی اثر استرس های شیمیایی و فیزیکی بر ساختار و ویژگی های آمیلوئیدی انسولین استیله و غیر استیله
انسولین از جمله پروتئین هایی است که در شکل مونومر تمایل بیشتری به تشکیل فیبر آمیلوئیدی دارد. مطالعات پیشین نشان داده اند که با بهره گرفتن از ترکیبات شیمیایی (اوره، TFE و EDTA) و گرما می توان فیبریلاسیون پروتئین انسولین را تسریع کرد. ترکیبات واسرشته کننده شیمیایی و گرما با تخریب نیروهای دخیل در تشکیل ساختار های دوم و سوم پروتئین مانند پیوندهای هیدروژنی و دیگر برهمکنش های غیرکووالان فرایند تشکیل فیبر آمیلوئیدی پروتئین را القا می کنند. EDTA با جدا کردن یون روی از انسولین، این پروتئین را از شکل هگزامر به شکل مونومر تبدیل می کند.
در این پژوهش نمونه ی انسولین که به مدت ۲۰ روز در مجاورت آسپیرین انکوبه شده بود به همراه نمونه ی کنترل که هیچ کدام نشانه ای از توده ای شدن نداشت درمعرض استرس فیزیکی (دمای ۶۰ درجه سانتی گراد به مدت ۲ ساعت) و استرس شیمیایی (اوره، TFE و EDTA) قرار گرفت. لازم به یادآوری است که استیلاسیون نمونه ی انسولین مجاور شده با آسپیرین برای مدت زمان ۲۰ روز قبلا با آزمون OPA و فلورسامین تائید شده بود (بررسی این نمونه با آزمون OPA، ۴۶ درصد استیله شدن را نشان می دهد).
نمونه های متفاوت انسولین (۲ میلی گرم در میلی لیتر) در حضور اوره (۳ مولار) و TFE (10 درصد) به مدت ۱۵ ساعت انکوبه شد. همچنین نمونه های انسولینی در غلظت ۲ میلی مولار EDTA به مدت ۱۲۰ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه شد. در ادامه تغییر قطبیت محیط اطراف تیروزین نمونه های مختلف انسولینی متاثر از استرس های شیمیایی و فیزیکی از طریق ثبت طیف نشری آن ها مطالعه شد. همچنین سطوح آبگریز در معرض حلال و تشکیل فیبر آمیلوئیدی این نمونه های پروتئینی به ترتیب با فلورسانس عارضی ANS و آزمون نشر فلورسانس پروب تیوفلاوین T بررسی شد.
بررسی فلورسانس ذاتی نمونه های مختلف انسولینی تحت تاثیر عوامل شیمیایی و فیزیکی نتایج مشابهی را نشان می دهد (شکل ۴-۱۳). بدین ترتیب که در تمامی استرس های مطالعه شده نشر فلورسانس ذاتی نمونه انسولین استیله در مقایسه با دو نمونه ی دیگر کمتر می یابد. کاهش نشر فلورسانس ذاتی نشان دهنده ی تغییر قطبیت محیط اطراف تیروزین ها به دلیل تغییرات ساختاری در حضور این عوامل می باشد. همانطور که در شکل ۴-۱۴ مشاهده می شود نشر فلورسانس ANSنمونه ی استیله در حضور اوره و TFE از نمونه ی انسولین تازه تهیه شده و غیر استیله کمتر می باشد. این نتایج نشان می دهد که سطوح آبگریز در معرض نمونه ی استیله در حضور استرس های شیمیایی اوره و TFE در مقایسه با نمونه ی غیر استیله کمتر می شود. همچنین نشر فلورسانس ANS نمونه ی استیله متاثر از گرما و EDTA نسبت به دو نمونه ی دیگر افزایش می یابد. استرس های شیمیایی مختلف ساختارهای فضایی متفاوتی به پروتئین می دهد به طوری که سطح آبگریز در معرض در بعضی از این ساختارهای فضایی بیشتر و در بعضی کمتر است.
شکل ۴-۱۳- مطالعه ی نشر فلورسانس ذاتی نمونه های متفاوت انسولین در حضور استرس شیمیایی و فیزیکی.
طیف نشری تیروزین های نمونه های انسولین انکوبه شده با آسپیرین به مدت ۲۰ روز به ترتیب A) در عدم حضور استرس، B) در حضور اوره ۳ مولار ،C ) در حضور TFE 10 درصد،D ) در حضور ۲ میلی مولار EDTA و E) در حضور دمای ۶۰ درجه ی سانتی گراد ثبت شد. حروف F،N و Ac به ترتیب معرف نمونه های انسولین تازه تهیه شده، انسولین غیراستیله و انسولین استیله می باشد.