در روش مستقیم نیز که توسط Watanabe و همکاران (۱۹۸۳، ۱۹۸۲) توسعه پیدا کرد نیاز به روغن های امولسیون شده ماهی (مثل روغن کبد) و یک ترکیب متیل استر n-3 HUFA می باشد. امولسیون مذکور به ناپلی آرتمیا خورانده می شود که در بدنش تجمع پیدا کند. گزارش شده که با این روش مقدار n-3 HUFA به ۰۱/۱% یا ۱/۱۰ میلی گرم در هر گرم وزن آرتمیا می رسد (Bengtson et al., 1991; Lavens et al., 1996).
۱-۲-۶-۱-۳- تکنیک غنی سازی فرانسوی
در این تکنیک که توسط Robin و همکاران (۱۹۸۳) ابداع شده است، از مواد غذایی ترکیبی استفاده می شود. عمل غنی سازی ناپلیوس آرتمیا در این روش در دو مرحله صورت انجام می گیرد که در فاز اول ترکیبی از مواد غذایی شامل پودر اسپیرولینا^[۱۲]، مخمر، اسیدهای آمینه، ویتامین ها، کلسترول و روغن ماهی به صورت پیش تغذیه طی ۴۸ ساعت در اختیار ناپلی آرتمیا قرار گرفته و به دنبال آن در مرحله دوم حمام غنی سازی نیم ساعته با بهره گرفتن از مواد دیگری چون انواع مواد معدنی، ویتامین ها و روغن ماهی انجام می گیرد. با این روش غنی سازی سطوح n-3 HUFA به ۱۶ میلی گرم در هر گرم وزن خشک آرتمیا می رسد. همچنین به وسیله Robin و همکاران (۱۹۸۷) سطوح بالاتر (۲۵ میلی گرم در هر گرم وزن خشک ناپلیوس)، به واسطه استفاده از مقدار روغن بیشتر در رژیم پیش تغذیه گزارش شده است.
گزارش شده است که با بهره گرفتن از پودر خیلی ریز و خالص اسکوئید^[۱۳] میزان n-3 HUFA بعد از ۹۶ ساعت به حداکثر مقدار یعنی ۴/۱۵ میلی گرم در هر گرم وزن خشک آرتمیا می رسد، در حالی که این میزان بعد از ۲۴ ساعت غنی سازی به ۹/۵ میلی گرم در هر گرم می رسد. با جایگزین کردن نسبت ۲۵ درصد پودر اسکوئید با رژیم امولسیون غنی سازی همچون سوپرسلکو^[۱۴] میزان n-3 HUFA به ترتیب به mg/g 12 و mg/g 38 وزن خشک (بعد از ۲۴ و ۹۶ ساعت) افزایش می یابد (Bengtson et al., 1991).
۱-۲-۶-۱-۴- تکنیک غنی سازی بلژیکی
اساس کار در این تکنیک غنی سازی با ذرات میکرونی کپسول شده است(Leger et al., 1985). در ابتدا ذرات میکرونی مانند آرد برنج را با روغن های ماهی پوشانده و بعد از غنی سازی ناپلیوس آرتمیا با این رژیم، درصد بالای ۱۵ میلی گرم n-3 HUFA در هر گرم وزن خشک آن به دست می آید (Leger et al., 1985). به واسطه پیچیدگی و همچنین هزینه بالای ساخت این محصولات، تکنولوژی جدیدی به نام تغلیظ امولسیون خودبخودی^[۱۵] برای موثر بودن مواد غنی کننده به اجرا درآمد (Leger et al., 1987). این رژیم یک مخلوط پیچیده خود امولسیون شونده است که به طور عمده از منابع n-3 HUFA، ویتامین ها، کارتنوئیدها و فسفولیپیدها تشکیل شده است. به طوری که به محض قرار گرفتن در آب شور به صورت ذرات میکرونی کروی خیلی نرم شکل گرفته و به راحتی توسط ناپلی آرتمیا بلعیده می شود. میزان اسیدهای چرب غیراشباع ضروری در این روش به طور شگفت انگیزی نسبت به سایر روش ها پیشی گرفته به طوری که میزان آن بعد از ۲۴ ساعت غنی سازی به ۳/۳۸ تا ۵/۵۳ میلی گرم در هر گرم وزن خشک آرتمیا و ۶/۸۷ میلی گرم در هر گرم وزن خشک بعد از ۴۸ ساعت رسید (Leger et al., 1986).

۱-۲-۶-۲- اهمیت غنی سازی
آرتمیا به عنوان یک حامل توانایی انتقال انواع مواد مختلف در مقادیر متفاوت را به آبزیان بالاتر دارد.
به وسیله غنی سازی می توان از آلودگی آب محیط پرورش (در صورت تلقیح ماده موردنظر در محیط) جلوگیری کرد زیرا مواد در تماس مستقیم با آب پرورش قرار نمی گیرند.
بسیاری از مواد غنی کننده مانند اسیدهای چرب و ویتامین ها یا آنتی بیوتیک ها دارای نیمه عمر مفید هستند و پس از مدتی در آب بی اثر شده و موجب آلودگی آب می شوند، اما در صورت استفاده از آرتمیا به عنوان حامل این مواد در آب پخش نشده و ایجاد آلودگی نخواهند کرد.
معمولاً مواد غذایی به سرعت در آب ته نشین شده و از محدوده مصرف آبزیان خارج می شوند ولی در غنی سازی آرتمیا از اتلاف این مواد جلوگیری کرده و مواد تا ذره آخر مصرف خواهند شد. این مسئله در استخرهای بزرگ پرورش آبزیان اهمیت بسزایی دارد. همچنین مقدار کمتری از ماده مورد نظر در مقایسه با روش مستقیم مصرف می شود.
در صورت استفاده از روش غنی سازی، کارشناس مطمئن می شود که ماده مورد نظر توسط آبزی مصرف شده است و ته نشین نشده و یا از بین نرفته است. همچنین از برطرف شدن مزه نامطبوع ماده مورد نظر (مثلاً داروها) درمذاق ماهی مطمئن شده و آبزی به راحتی آنتی بیوتیک یا ماده غنی کننده دیگر را مصرف خواهد کرد (مناف فر، ۱۳۸۰).
استفاده از آرتمیای غنی شده باعث بهبود عملکرد پرورش لاروها، از لحاظ رشد و بقا، می شود و عملکرد لاروها در مراحل انتهایی پرورش بهبود می یابد. لارو تغذیه شده با آرتمیای غنی شده سالم تر می باشد و به شرایط پر از استرس از قبیل بیماری ها، زمان تغذیه فعال، انتقال بچه ماهی یا پست لارو از مخازن هچری به استخرهای پرواری مقاوم تر است (Leger et al., 1987).
۱-۲-۶-۳- معایب غنی سازی
هرچند که غنی سازی، ارزش تغذیه ای آرتمیا را بهبود می بخشد اما روش های غنی سازی می توانند سبب اثرات نامطلوبی از قبیل مرگ و میر و رشد سریع ناپلی شوند که برای لاروهای با فضای دهانی کوچک نامطلوب می باشد (Figueiredo et al., 2009). شاید روش های بهینه سازی غنی سازی، این اثر نامطلوب را با به دست آوردن غنی سازی در مدت زمان کمتر کاهش دهند (Leger et al., 1987). استفاده از آرتمیای غنی شده با اندازه بزرگ، ممکن است برای لاروها در مراحل اولیه مشکل ایجاد نماید ولی با بهره گرفتن از متاناپلی غنی شده در تغذیه آبزیان بزرگ تر می توان این مشکل را برطرف کرد (Figueiredo et al., 2009). در عوض ناپلیوس های تازه تخم گشایی شده دارای ارزش غذایی بیشتر و اندازه کوچکتر را می توان برای لاروهای آبزیان در مراحل اولیه رشد استفاده کرد. روش غنی سازی آرتمیای بالغ با ناپلی یکسان بوده و تنها تفاوت، در اندازه ذرات غذایی و تراکم لاروها در تفریخگاه ها می باشد (آق، ۱۳۸۱)..
از دیگر محدودیت های غنی سازی می توان به مواردی از جمله آرتمیا به طور انتخابی بعضی از مواد مغذی مانند DHA و فسفولیپیدها را کاتابولیز می کند، اشاره کرد. کاتابولیسم DHA به نژاد آرتمیا بستگی دارد و می توان بر بخشی از آن، از طریق استفاده از نژادهای با منشأ جغرافیایی متفاوت غلبه کرد (Sorgeloos et al., 2001).
۱-۲-۶-۴- عوامل موثر بر میزان استفاده از ماده غنی سازی
عواملی از جمله:
نوع ماده غنی کننده
ثبات جیره مورد مصرف در محیط غنی سازی
تراکم ماده غنی کننده در محیط کشت
اندازه ذرات غنی کننده
روش غنی سازی
ساختار ژنتیکی گونه آرتمیای مورد آزمایش
دمای محیط کشت
در میزان غنی سازی با مواد ذکر شده نقش دارند. منشا جغرافیایی گونه آرتمیا، رژیم غذایی غنی سازی و شرایط غنی سازی (مراحل رشد اولیه ناپلی، زمان غنی سازی، دوز و نوع امولسیون) از بارزترین عوامل تاثیرگذار روی نتایج غنی سازی می باشند (Leger et al., 1987).
۱-۲-۶-۵- اساس غنی سازی خوب
حداکثر غنی سازی (رسیدن به بالاترین میزان) در کوتاهترین مدت ممکن، اساس غنی سازی خوب است. این زمان به مدت زمان رسیدن ناپلیوس ها به اولین مرحله تغذیه ای (اینستار II) بستگی دارد و با سرعت تخم گشایی و هماهنگی تخم گشایی سیست ها در ارتباط است. فاصله زمانی هماهنگی تخم گشایی از ۵ تا ۱۷ ساعت متغیر است که اگر زمان هماهنگی تخم گشایی کوتاه باشد یعنی سیست ها بتوانند در زمان محدودتری با هم تخم گشایی شوند و سرعت تخم گشایی بالاتر باشد نتایج بهتری در غنی سازی حاصل می شود چرا که این امر جذب کلی ماده مغذی را در توده ناپلیوس ها افزایش می دهد (Leger et al., 1987). هنگامی که زمان هماهنگی تخم گشایی در طول زمان دسترسی به جیره غنی سازی طولانی تر باشد هنوز تعدادی از ناپلیوس ها تغذیه را شروع نکرده اند و این جذب کلی ماده مغذی در توده ناپلیوس را کاهش می دهد (Leger et al., 1997).
نسبت DHA/EPA عامل اصلی برای شناسایی بهترین روش غنی سازی است. Park و همکاران (۲۰۰۶) و Garcia و همکاران (۲۰۰۸) نشان دادند که نسبت EPA/ARA برای ماهی کاد^[۱۶] در مقایسه با نسبت DHA/ARA می تواند شاخص بهتری برای رشد و بقای لارو ماهی کاد باشد. EPA و ARA هر دو پیش ماده ایکوزانوئید (ترکیباتی که در عملکردهای فیزیولوژیکی مختلفی دخیل هستند) می باشند (Izquierdo et al., 2000; Bell and Sargent, 2003; Koven et al., 2003). Sargent و همکاران (۱۹۹۹) نشان دادند، ایکوزانوئیدهایی که از EPA تولید می شوند از لحاظ بیولوژیکی کمتر فعالند بنابراین نسبت کوچکتر EPA/ARA می تواند برای رشد لاروی بهتر باشد. Sargent و همکاران (۱۹۹۹) نشان دادند که بهترین شاخص برای رشد و بقای لاروها نسبت DHA/EPA/ARA می باشد که نسبت بهینه برای لارو ماهیان دریایی حدود ۱/ ۵/۱۰ می باشد. با توجه به اینکه لارو ^[۱۷]Haddock میزان بیشتری ARA را نیاز دارد، محققان به این نتیجه رسیدند که نسبت بهینه این سه اسیدچرب برای این گونه باید نزدیک به ۴/۵/۴۰ باشد (Castell et al., 2001).
۱-۲-۶-۶- انواع رژیم های غذایی برای غنی سازی اسیدهای چرب آرتمیا
از انواع رژیم های غذایی مورد استفاده برای غنی سازی آرتمیا می توان از جلبک های میکروسکوپی مثل کلرولای دریایی، مخمرها مثل مخمر امگا، آب پنیر، ذرات ریز آغشته به محلول های غنی سازی نظیر ذرات سبوس برنج آغشته به روغن کبد ماهی و یا ذرات سبوس برنج آغشته به روغن ماهی و نیز امولسیون های آماده مصرف که با اسامی تجاری مختلف، (از جمله ICES30/4/C، حاوی دو اسید چرب HUFA (DHA , EPA)) اشاره کرد که در بازار موجود بوده و با حل کردن آن ها در آب دریا و هوادهی یا هم زدن شدید، میکروگلبول های بسیار ریزی در آب تشکیل می شود که مورد استفاده آرتمیاست (Leger et al., 1987).
۱-۲-۶-۶- ۱- غنی سازی با امولسیون چربی و اسیدهای چرب
با توجه به ترکیب اسیدهای چرب در سیست ها و ناپلیوس های تخم گشایی شده در سویه های مختلف آرتمیا به ویژه در ناپلیوس آرتمیا ارومیانا مشخص می شود که اگرچه در بدن ناپلیوس ها اسیدهای چرب غیراشباع و اشباع موجود است ولی نسبت اسیدهای چرب غیراشباع به مراتب بیشتر از اشباع می باشد که این نشان از اهمیت این اسیدها در رشد و بلوغ آرتمیا دارد. البته اختلافات قابل ملاحظه ای بین ترکیب اسیدهای چرب در گونه های مختلف وجود دارد که این تفاوت می تواند به دلیل اختلاف ماده ژنتیکی یا اختلافات تغذیه ای والدین تولیدکننده این سیست ها باشد (Schauer et al., 1980).
۱-۲-۶-۶- ۲- فسفولیپیدها
اگرچه نیاز به فسفولیپید در مراحل جوانی برخی از گونه های ماهیان اثبات شده است اما فقط اطلاعاتی مربوط به نقش فسفولیپیدها در مرحله تغذیه فعال در دسترس است (Coutteau et al., 1997). غنی سازی آرتمیا با Phosphatidyicholine (PC) میزان PC را در آرتمیا افزایش نمی دهد (Tackaert et al., 1991). Rainuzzo و همکاران (۱۹۹۴) ترکیب چربی مشابهی را در آرتمیای غنی شده با امولسیونی بر اساس اتیل استرها یا تخم هالیبوت دریافتند که دارای ۶/۷۲% چربی های خنثی (عمدتاً اتیل استرها) و ۲/۷۱% چربی های قطبی (عمدتاً PC و Phosphatidylethanolamine و PE) بود. مخلوط فسفولیپیدها با نمک های سدیم DHA منجر به جذب حداکثر فسفولیپیدهای DHA در آرتمیا شد (Harel et al., 1999) و می توان از آن برای افزایش میزان چربی قطبی در غذای زنده لاروی استفاده کرد (Sorgeloos et al., 2001).
۱-۲-۶-۶- ۳- ویتامین ها
درون سیست های غیرفعال آرتمیا، اسکوربیک اسید ۲-سولفات (AAS)، (یکی از مشتقات پایدار اسکوربیک اسید) گزارش شده است (Mead and Finamore, 1969). سیست های گروه های مختلف، میزان AAS متفاوتی دارند که میزان آن در محدوده g/g DWµ ۵۱۷ – ۱۶۰ می باشد (Dabrowski, 1991; Merchie et al., 1995a). میزان اسکوربیک اسید آزاد شده در ناپلی تازه تخم گشایی شده، وجود ذخیره AAS را در سیست ها نشان می دهد و شواهدی وجود دارد که نشانگر تبدیل AAS به ^[۱۸]AA آزاد در طول اتمام مرحله جنینی به ناپلی می باشد (Golub and Finamore, 1972; Dabrowski, 1991; Nelis et al., 1994).
تفاوت مشاهده شده در میزان AAS در سیست های آرتمیا، اختلاف در مواد مغذی بالغین را در طول تولید تخم نشان می دهد همانگونه که برای میزان HUFA ثابت شده بود (Lavens et al., 1989). این یافته می تواند تفاوت بین گروه های همان نژاد را توضیح دهد (Merchie et al., 1995). تفاوت بین جمعیت های جغرافیایی و گونه های آرتمیا و آرتمیا های یک نسل در سال های متفاوت می تواند به طور قابل توجهی میزان AAS موجود در سیست، و بنابراین میزان AA را در ناپلی تازه تخم گشایی شده و در نتیجه ارزش غذایی آن برای لارو ماهی را تحت تاثیر قرار دهد (Sorgeloos et al., 2001).
میزان ویتامین A را در ناپلی آرتمیا می توان از ۳/۱ بهIU/g DW 1283 در طی ۱۸ ساعت، از طریق افزودن پالمیتات ویتامین A به امولسیون زرده تخم مرغ و غنی سازی ناپلی با این ترکیب، بالا برد (Dedi et al., 1995).
۱-۲-۷- عوامل موثر در ترکیب اسیدهای چرب ناپلیوس آرتمیا
تفاوت های مشخص در ترکیب اسیدهای چرب ناپلیوس سویه های مختلف آرتمیا و حتی در یک سویه می تواند ناشی از ساختارهای ژنتیکی یا ناشی از اختلافات تغذیه ای والدین این ناپلیوس ها و یا نتیجه هر دو باشد (Schauer et al., 1980).
۱-۲-۷-۱- ژنتیک
ثابت شده که آرتمیا نیاز محدودی به تولید EPA برای خود دارد (Leger et al., 1987). هچنین ثابت شده که آرتمیا قادر است ۱۸:۳n3 را به EPA (20:5n3) تبدیل کند (Leger et al., 1987). در غنی سازی دو گونه A. franciscana و A. salina تفاوت فاحشی در میزان جذب HUFA بین دو گونه ناپلی مشاهده شده است و نشان می دهد که احتمالاً میزان الحاق HUFA در ناپلی به مشخصات ژنتیکی گونه وابسته است. به علاوه با گرسنگی دادن ناپلیوس های غنی شده به مدت ۷۲ ساعت گونه چینی (A. salina) ظرفیت بالایی از حفظ DHA را نشان داده است و نتیجه گیری شده احتمالاً متابولیسم DHA به خصوصیات ژنتیکی سویه آرتمیا بستگی دارد (Sorgeloos et al., 1997).
۱-۲-۷-۲- عوامل محیطی (اختلافات تغذیه ای والدین)
مقادیر HUFA در آرتمیا به شدت به غذایی که آرتمیا از آن تغذیه کرده بستگی دارد. در آزمایشی ناپلیوس های آرتمیایی حاوی ۵ درصد EPA در یک سیستم کنترل شده تولید سیست کشت داده شدند و دو نوع جیره متفاوت مورد استفاده قرار گرفت. یکی حاوی ۷/۶% و دیگری حاوی ۷/۰% از EPA بود. سیست های تولید شده به وسیله بالغ هایی که در جیره غنی از EPA رشد کرده بودند حاوی مقادیر زیادی از EPA بودند در حالی که بقیه حاوی مقادیر بسیار پایینی از این اسیدچرب بودند. اگر بتوان این نتایج را به کل جمعیت در یک زیستگاه تعمیم داد می توان نتیجه گرفت که شرایط غذایی متفاوت در دریاچه ها و آبگیرهای آرتمیا احتمالاً عامل اختلافات ترکیب اسیدهای چرب در سویه های مختلف و حتی داخل یک سویه است (Leger et al., 1987).
یک مشخصه مهم در ارزیابی ارزش غذایی هر نوع ماده غذایی اندازه گیری میزان چربی آن است. چربی های تری گلیسریدی منبع اصلی انرژی قابل متابولیزه شدن در جیره آبزیان هستند و مستقیماً با رشد ارگانیسم های مصرف کننده مرتبط هستند (Schauer et al., 1980).
میزان چربی و انرژی آرتمیا در سویه های مختلف (نسبت به وزن خشک) با طی مراحل مختلف رشد کاهش می یابد. به طوری که بیشترین میزان چربی و محتوای انرژی به ترتیب مربوط به سیست فاقد کپسول است و ناپلیوس می باشد و به همین ترتیب میزان چربی در بالغین پایین تر از ناپلیوس است (Fujita et al., 1980).
تفاوت در میزان چربی و انرژی سیست سویه های مختلف می تواند به دلیل اختلافات ساختار ژنتیکی یا اختلافات تغذیه ای والدینی باشد که این سیست ها را تولید کرده اند (Schauer et al., 1980). به علاوه اختلاف در محتوای انرژی ناپلیوس سویه های مختلف می تواند ناشی از اختلاف در سرعت رشد در بین سویه های مختلف آرتمیا باشد (Schauer et al., 1980). دلیل دیگر این امر می تواند مربوط به طول زمان هماهنگی تخم گشایی باشد. در واقع هر چه این زمان طولانی تر شود اولین ناپلیوس های تفریخ یافته بخش عمده انرژی خود را تا زمان تخم گشایی مصرف کرده و از دست خواهند داد (Schauer et al., 1980).