ارلن مایر ، شوری سنج ، دماسنج دیجیتال ، میکروسکوپ ، انواع ظروف آزمایشگاهی ، اتوکلاو ، اسپکتروفتومتر ، سانترفوژ ، انکوباتور ، پمپ هوا ، شیلنگ هوا ، لام همو سیتو متر ، پیپت بلند وپیپت پاستور ، میکروسمپلر ، هود ، قفسه های فلزی مجهز به لوله های هوا ولامپ های مهتابی ، چراغ الکلی، تراز دیجیتال ، ساعت آزمایشگاهی ، PH متر پرتابل و … بوده است .
۳-۳٫ روش کار
روش کار در سه مرحله صورت پذیرفت :
۳-۳-۱ . مرحله تهیه وآماده سازی پساب شهری :
ابتدا پساب شهری را از تصفیه خانه فاضلاب بندرعباس پس از مرحله ته نشینی اولیه توسط آشغالگیر مکانیکی ، به عنوان محیط کشت جایگزین جمع آوری وسپس برای از بین بردن هر گونه آلودگی میکروبی وباکتریابی وهمچنینی اطمینان از عدم وجود هر گونه میکروارگانیسمی غیراز فیتوپلانکتون مورد نظر ، در داخل ارلن مایرهای ۲۵۰cc ریخته وبا استفاده از استاپر وفویل درب آنها را بسته و در داخل اتوکلاو با دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد و به مدت ۱۵ دقیقه و در فشار ۵/۱ اتمسفر قرار داده تا استریل شوند (Suva, 1999) .

۳-۳-۲٫ مرحله تهیه محیط کشت f/2 وکشت خالص فیتوپلانکتون :
از آنجایی که هدف تولید کشت تک وخالص فیتوپلانکتون می باشد ، ابتدا باید به تهیه استوک خالص فیتوپلانکتون مورد نظر اقدام نمود . بدین منظور اقدامات زیر صورت پذیرفت :
۳-۳-۲-۱٫آماده سازی اولیه :
ابتدا کلیه لوازم مورد نیاز برای کشت فیتوپلانکتون از جمله ظروف شیشه ای باید پس از پایان کار هر دوره و قبل از شروع دوره جدید با اسید کلریدریک ولوازم شوینده ، خوب شسته شده سپس با آب مقطر والکل ومجدداً با آب مقطر شسته وپس از خشک شدن توسط اتوکلاو استریل شوند .
۳-۳-۲-۲٫تهیه استوک اولیه :
استوک اولیه این سلول ها که با عنوان استارتر نیز از آنها نام برده می شود به عنوان اولین نسل وارد
محیط جدید شده وبقیه سلول هایی که بعداً ایجاد خواهد شد در نتیجه تقسیم و ازدیاد این سلول ها خواهد بود . بنابراین اهمیت انتخاب بهترین استارتر جهت شروع کشت هایی بعدی به وضوح روشن می باشد . ذکر این نکته الزامی است که سلول های تلقیح اولیه از کشت های کوچکتر برای کشت های با حجم بزرگتر و یا از کشت های همسان برای تجدید همان کشت ها اخذ می گردد و هرگز نباید از کشت هایی با حجم بزرگ برای شروع کشت های کوچک استارتر استفاده گردد . در انتخاب این سلول ها باید دقت شود که در بهترین وضعیت از لحاظ شکل ظاهری باشند و کشتی که از آن به عنوان استارتر استفاده می شود در مرحله رشد انفجاری باشد تا کیفیت وکمیت سلول ها در وضعیتی باشد که کشت جدید نیز با موفقیت روبرو گردد . بنابراین در این آزمایش استوک مورد نیاز جهت شروع کار کشت فیتوپلانکتون ، از منطقه تیاب – کلاهی ( پرورش میگو ) تهیه شد .
۳-۳-۲-۳٫تهیه آب با شوری مورد نظر :
در این مرحله آب دریا پس از ذخیره شدن در تانک های ۱۰-۵ تنی ، با بهره گرفتن از یک دستگاه پمپ پر قدرت از داخل فیلترهای ۲۰، ۱ و ۵/۰ میکرون (Doroudi & Southgate , 2000) و پس از آن از داخل یک دستگاه UV عبور داده می شده تا آبی عاری از هر گونه ذرات معلق وتقریباً استریل مهیا گردد ، سپس آنها را در داخل ظروف شیشه ای تمیز آماده شده ریخته وشوری آن را توسط آب مقطر به اندازه مورد نظر کاهش می دهیم .
۳-۳-۲-۴٫ کشت خالص فیتوپلانکتون Spirolina plantensis و Chaetoceros muelleri
با افزودن مقدار معین از استوک های مواد مغذی وسیلیکات به آب دریای استریل شده با شوری ۲۵-۲۲ ppt وقرار دادن دراتوکلاو با دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد و فشار ۱ اتمسفر به مدت ۱۵ دقیقه ، محیط کشت f/2 آماده گردید . سپس با اضافه نمودن استوک ، ابتدا در ظروف ۲۰cc و سپس در حجم های ۵۰۰cc ، استوک خالص Spirolina plantensis و Chaetoceros muelleri کشت داده شد . کشت های استوک ممکن است ۲-۱ هفته بسته به شرایط محیط نگهداری شوند . تمامی استوک های کشت داده شده را می توان تحت شرایط غیر هوادهی و به طور ساکن نگهداری کرد اما این مستلزم تکان دادن به آرامی و به صورت ۲-۱ بار در روز برای معلق نگهداشتن سلول ها می باشد (Suva, 1999) .
۳-۳-۳٫مرحله انجام آزمایش
دو دسته آزمایش جهت بررسی میزان رشد Spirolina plantensis و Chaetoceros muelleri در پساب شهری و میزان تأثیر آن در غلظت ازت و فسفر پساب انجام پذیرفت :
۳-۳-۳-۱٫بررسی میزان رشدSpirolina plantensis و Chaetoceros muelleri در پساب شهری :
در این دسته از آزمایشات به طور کل ۶ تیمار که هر کدام دارای ۳ تکرار بودند آماده گردید که ۵ تیمار مربوط به پساب با غلظت های مختلف و یک تیمار شاهد بوده است (Koening & demacedo , 2004 ) شامل :
تیمار ۱ : محیط کشت f/2در آب دریای استریل شده به عنوان شاهد
تیمار ۲ :۲۰ درصد پساب شهری و ۸۰ درصد آب دریای استریل شده
تیمار ۳: ۴۰ درصد پساب شهری ۶۰ درصد آب دریای استریل شده
تیمار ۴ : ۶۰ درصد پساب شهری و ۴۰ درصد آب دریای استریل شده
تیمار۵ : ۸۰ درصد پساب شهری و ۲۰ درصد آب دریای استریل شده
تیمار۶: ۱۰۰ درصد پساب شهری
در این مرحله پس از اینکه رشد فیتوپلانکتون در استوک خالص به حداکثر خود رسید ، با بهره گرفتن از لام هموسیتومتر اقدام به شمارش سلول های فیتوپلانکتونی نموده و به هر یک از تکرارها و در مجموع به تمام تیمارها (۱۸ تکرار ) به تعداد مساوی یعنی سلول در میلی لیتر تزریق گردید (Tam & Wong , 1996) .
۳-۳-۳-۱-۱٫شرایط نگهداری تیمارها :
تمامی تیمارها وتکرارها تحت شرایط یکسان دمایی (۲۵-۲۲ درجه سانتی گراد ) وروشنایی ۵۰۰۰-۲۵۰۰ لوکس توسط لامپ های فلورسنت سفید با فاصله ۱۵-۱۰ سانتیمتری و به صورت روشنایی دائمی در طی یک دوره ۲۱روزه کشت داده شدند (Koening & Demacedo , 2004) . جهت جلوگیری از رسوب گذاری و شناوری فیتوپلانکتون ها و همچنین ایجاد سطح تماس بیشتر فیتوپلانکتون ها با پساب ، هوادهی در تمام طول دوره و برای همه تیمارها به طور یکسان ومداوم برقرار بوده است .
۳-۳-۳-۱-۱٫ نمونه برداری :
به صورت یک روز در میان از تمامی تیمارها به مقدار برابر نمونه برداری می شد . برای اینکه از نظر زمانی اختلافی بین تکرارها پیش نیاید ، نمونه برداری از هر تیمار را یک نفر و به طور همزمان انجام می داد . نمونه ها پس از جمع آوری در داخل بشر ۴۰cc ریخته شده و جهت جلوگیری از تغییرات احتمالی در تعداد سلول ها وهمچنین سهولت و دقت کار در هنگام شمارش تعداد ، یک قطره فرمالین ۵ درصد به آن تزریق می گردید . پس از آن با بهره گرفتن از لام هموسیتومتر در زیر میکروسکوپ با لنز ۴۰ اقدام به شمارش سلول ها نموده و تعداد آنها در واحد حجم ( یک میلی لیتر ) محاسبه شد (Bayne , 1976) . شوری هر تیمار نیز از روش تیتراسیون با نیترات نقره اندازه گیری گردید .
۳-۳-۳-۲٫ بررسی میزان تأثیر Spirolina plantensis و Chaetoceros muelleri در غلظت ازت وفسفر پساب :
در این دسته از آزمایشات به طور کل ۴ تیمار که هر کدام دارای ۳ تکراربودند آماده گردید .
۳ تیمار حاوی ۲۵۰ میلی لیتر پساب شهری استریل شده مربوط به ۳ تراکم متفاوت فیتوپلانکتون و یک تیمار شاهد بوده است ، شامل :
تیمار A : پساب شهری استریل شده بدون تراکم فیتوپلانکتون به عنوان شاهد
تیمار B : پساب شهری محتوی سلول در میلی لیتر ( تراکم پایین )
تیمار C : پساب شهری محتوی سلول درهرمیلی لیتر ( تراکم متوسط )
تیمار D : پساب شهری محتوی سلول درهر میلی لیتر ( تراکم بالا )
تراکم های فوق بااستفاده ازلام هموسیتومترشمارش شده و به محیط کشت ها اضافه گردید (Lau et al ,. 1994).
۳-۳-۳-۲-۱٫ شرایط نگهداری تیمارها :
تمامی تیمارها در شرایطی مشابه با آزمایشات قبلی در طی یک دوره ۱۴ روزه کشت داده شدند .
۳-۳-۳-۲-۲٫نمونه برداری :
در فواصل زمانی سه روزه از تیمار ۴۵ میلی لیتر نمونه جمع آوری گردید . سپس نمونه ها در ۳۰۰۰ دور به مدت۵دقیقه سانتریفوژ شدند (Lau et al,. 1994) . غلظت فسفات و فرم هایی از نیتروژن مانند نیتروژن نیترینی و نیتروژن نیتراتی توسط روش های استاندارد اندازه گیری با بهره گرفتن از دستگاه اسپکتروفتومتر ماوراء بنفش تعیین گردید (APHA, 1995 ) . اندازه گیری PH پساب نیز با یک دستگاه PH متر پرتابل اندازه گیری و ثبت می شد . همه نمونه گیری ها در دوره نوری و زمان مشابه ای از روز صورت گرفتند .
۳-۴٫تجزیه و تحلیل داده ها:
در این پژوهش ابتدا داده ها وارد نرم افزار اکسل و سپس با بهره گرفتن از این نرم افزار جداول و نمودارهای مورد نیاز ترسیم گردیده اند . جهت انجام تجزیه و تحلیل آماری از نرم افزار SPSS نسخه ۱۷ استفاده گردید. به منظور بررسی و تعیین نرمال بودن یا نبودن دادها از آزمون های لون(Leven statistic) و کولموگروف - اسمیرنوف استفاده شد. پس از بررسی داده ها درصورت نامناسب بودن توزیع و نزدیکتر کردن داده ها به به یک توزیع نسبی نرمال از روش های مختلفی مانند جذر گرفتن یا لگاریتم گیری بر مبنای ۱۰ استفاده گردید. در غیر این صورت از آزمون های ناپارامتریک برای برای بررسی معنی دار بودن یا نبودن داده ها استفاده خواهد شد.در این تحقیق جهت مقایسه میانگین ها مابین تیمار های مختلف از آزمون آنالیز واریانس یکطرفه (برای تعیین صحت آزمون آنالیز واریانس از آزمون تکمیلی توکی (Tukey) استفاده شد). در صورت نرمال نبودن از آزمون معادل ناپارامتریک آنالیز واریانس یعنی آزمون کروسکال والیس استفاده خواهد شد.در بخشی از مطالعات در صورت نیاز، از آزمون t نیز استفاده می گردد که در صورت نرمال نبودن داده ها از آزمون ناپارامتریک معادل آزمون T یعنی آزمون آزمون من ویتنی استفاده خواهد شد.
۳-۵٫کنترل کیفی وعملیات بهداشتی
مکان های کشت غذای زنده نیاز به رعایت نکات بهداشتی داشته و عدم موفقیت در این زمینه ناشی از خطاهای انسانی شامل عدم رعایت بهداشت ، بی دقتی در دستکاری و استفاده از وسایل نامناسب می باشد . بنابراین انجام اقداماتی مانند شستشوی روزانه مکان و ضدعفونی کف آن ، شستشوی مرتب دست وجلوگیری از ورود وخروج افراد غیر مسئول به مکان کشت غذای زنده و … لازم وضروری می باشد (Suva, 1999).
۳-۶٫ مدت زمان پژوهش
این پژوهش از زمان شروع کار یعنی از زمانی که استوک فیتوپلانکتون Spirolina plantensis و Chaetoceros muelleri کشت داده شد تا آماده سازی مقدمات کار (آماده سازی قفسه های نگهداری ارلن ها ،آماده سازی محیط کشت ،آماده ­سازی لامپ ها ، آماده سازی پمپ ها و لوله کشی هوا و­… ) حدوداٌ۶۰ روز به طول انجامید .