۵-۵- کونژوگاسیون PRP با اگزوتوکسین A…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….127
۵-۶- سرم باکتریسیدال اسی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….۱۲۸
نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. ……………………………………………………………….۱۲۹
پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. ………… …………………………………………………………۱۲۹
منابع…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… ۱۳۰
.
فهرست شکل ها
عنوان صفحه
شکل ۱-۱ کلونی هموفیلوس آنفلوانزا در محیط شکلات آگار……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..۱۹
شکل۱-۲ هموفیلوس آنفلوانزا………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….۲۰
شکل۱-۳ تیپ های مختلف کپسول هموفیلوس آنفلوآنزا…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………۳۵
شکل ۱-۴ پراکندگی سنی عفونت Hib از اکتبر ۱۹۹۰ تا سپتامبر ۱۹۹۱ در شش منطقه در انگلستان و والس. از ۴۳۳ مورد گزارش شده (۸۴%) ۳۶۲ مورد به علت hib ، (۱۳%) ۵۴ مورد به علت غیر سروتیپی و ۱۳ مورد سروتیپ نشده بودند…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….۴۱
شکال۳-۱- باز کردن سویه PTCC هموفیلوس آنفلوانزا……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..۶۷
شکال۳-۲- تیمار عصاره مخمر . چپ: تغییر رنگ آب در روز اول دیالیز عصاره مخمر.راست: روز سوم دیالیز عصاره مخمر بدون تغییر رنگ آب……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………۷۰
شکال۳-۳- فرمانتور Novo-Paljas کشور هلند………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………۷۱
شکال۳-۴ راست: اضافه کردن عصاره مخمر و فاکتور رشد – چپ : اضافه کردن بذر به محیط کشت…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..۷۲
شکال۳-۵رسوب حاصل از الکل زنی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..۷۴
شکل۳-۶ تهیه استانداردهای ریبوز(الف -قبل از حرارت ، ب – بعد از حرارت) …………………………………………………………………………………………………………….۷۸
شکل ۳-۷ رسوب با سولفات آمونیوم…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….۸۸
شکل ۳-۸ دیالیز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………۸۹
شکل ۴-۱کلونی هموفیلوس آنفلانزا روی محیط شکلات آگار………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………۱۰۷
شکل ۴-۲ تست آکروفلاوین…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….۱۰۷
شکل ۴-۳ طیف سنجی NMR ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….110
شکل ۴-۴ منحنی FTIR……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..111
شکل ۵-۵ آزمون ایمونوژل دیفیوژن…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….۱۱۶
شکل ۴-۶- الکتروفورز (SDS-PAGE) برای PRP-ETA و ETA…………………………………………………………………………………………………………………………………..117

فهرست جدول ها و نمودارها
عنوان صفحه
نمودار ۳-۱نمودار استاندارد لوری…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..۸۳
جدول ۴-۱ شاخص های فرمانتاسیون Hib جدول…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..۱۰۸
نمودار ۴-۱ تغییرات جذب نوری برای رشد Hib…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….109
نمودار ۴-۲ تغییرات PH در رشد Hib…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….109
نمودار ۴-۳ تغییرات گلوکز در رشد Hib……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………110
جدول ۴-۲ تهیه استاندارد برای غلظت ریبوز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………۱۱۲
نمودار ۴-۴- منحنی استاندارد ریبوز……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………۱۱۲
جدول ۵-۳- میزان ریبوز……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….۱۱۲
نمودار ۵-۵- منحنی استاندارد پروتئین……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………۱۱۳
جدول ۴-۴- میزان پروتئین……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………۱۱۳
جدول ۵-۴- میزان اسید نوکلئیک………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..۱۱۴
نمودار ۴-۶-منحنی OD فرکشن های کونژوگه …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………۱۱۵
جدول ۴-۵- عیـار آنتی بادی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….۱۱۸
جدول ۴-۶- تیتر آنتی بادی باکتری کشی واکسن کونژوگه (PRP-ETA) و PRP در روزهای ۱۵،۳۰، ۴۵٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫ ………………………………………………………………………………………………………………………………………….۱۱۹
چکیده
هموفیلوس آنفلوانزا سروتیپ b مهمترین عامل مننژیت و پنومونی در کودکان زیر ۵ سال در سراسر جهان می باشد که پس از کلونیزه شدن در حلق وارد خون شده و باکتریمی می دهد،در ادامه باکتری از طریق خون خود را به مننژ رسانده و مننژیت می دهد که عامل ۹۵% باکتریمی و مننژیت ها هموفیلوس آنفلوانزا تیپ b می باشد که از کپسول پلی ساکاریدی آن موسوم به پلی ریبوزیل ریبیتول فسفات (PRP) جهت تولید واکسن های کونژوگه گلیکوپروتئینی علیه هموفیلوس آنفلوانزا تیپ b استفاده شده است.به دلیل اینکه پاسخ ایمنی نسبت به این پلی ساکارید غیر وابسته به سلول T بوده و در پاسخ ایمنی سلول خاطره ایجاد نمی گردد،لذا دوز یادآور تاثیری در بالا بردن سطح ایمنی ندارد.برای از بین بردن خاصیت T-INDEPENDT،PRP به طور کوالانسی به اگزوتوکسین A سودوموناس آئروژینوزا (ETA) متصل می گردد.در این پروژه سویه استانانداردهموفیلوس آنفلونزا سروتیپ b ابتدا در فرمانتور حاوی محیط CY (کازآمینواسید – عصاره مخمر )کشت گردید و تخلیص PRP از مایع کشت با انجام روش های الکل پرسپیتاسیون (رسوب دادن الکلی) و رسوب دادن با ستاولن (هگزادسیل تری متیل آمونیوم بروماید)،التراساتریفیوژ و تخلیص با هیدروکسی آپاتیت حاصل گردید.جهت تهیه اگزوتوکسین A نیز سویه PA103 سودوموناس آئروژینوزا در محیط کشت تریپتیکازسوی براث کشت گردید و پس از سنجش توکسیسیته در موش با بهره گرفتن از روش قلیایی ،سم زدایی شده و جهت کونژوگه نمودن با PRP از ADHو سیانوژن بروماید به عنوان اسپیسر و EDAC به عنوان عامل لینکر استفاده گردید و کونژوگه حاصل با عبور از ستون CL-4B تخلیص شد.
کونژوگه بدست آمده جهت ارزیابی ایمونولوژیکی طی ۲ مرحله با فاصله ۱۴ روز به تعدای خرگوش سفید نیوزیلندی تزریق گردید و از هر کدام از خرگوش ها در روزهای ۰،۱۵،۳۰،۴۵ خونگیری از قلب انجام شد.تیتر آنتی بادی توسط سرم باکتریسیدال اسی اندازه گیری شد.تیتر باکتری کشی برای PRP خالص در تزریق اول ۱۶ و در تزریق دوم شاهد افزایش تیتر نبودیم.تیتر باکتری کشی برای کونژوگه در تزریق اول ۳۲ و در تزریق دوم ۶۴ بود که شاهد افزایش تیتر بودیم.با توجه به نتایج حاصل شده ،کونژوگه PRP-ETA سبب تحریک بیشتر سیستم ایمنی و افزایش تیتر آنتی بادی در تزریق دوم می گردد.همچنین اگزوتوکسین A دتوکسیفای شده یک کریر مناسب می باشد.
کلید واژه:
هموفیلوس آنفلونزا تیپ b، سودوموناس آئروژینوزا،واکسن کونژوگه، پلی ریبوزیل ریبیتول فسفات (PRP)، اگزوتوکسین A
مقدمه
۱-۱-۱ هموفیلوس آنفولانزا
هموفیلوس آنفولانزا یک باکتری گرم منفی است که اولین بار توسط Pfeiffer در سال ۱۹۸۲ توصیف شد.( پیفر،۱۹۸۲^[۲] ) این که هموفیلوس آنفلوآنزا انگل مخصوص انسان می­باشد باعث شد که این تصور بوجود بیاید که این باکتری عامل اصلی آنفلوانزا می­باشد. در هر حال از کالبدشناسی افرادی که مبتلا به حمله ناگهانی (به صورت تک­گیر) در طی پاندمی آنفلوآنزا در سال ۱۹۱۸ شده­بودند، هموفیلوس آنفلوآنزا دیده­ نشد.Pittman کشف کرد که سویه­هایی از این باکتری می­توانند در دو گروه کپسول دار (قابل تیپ­بندی) و بدون کپسول (غیر قابل تیپ­بندی) تقسیم بشوند( پیتمن،^[۳]۱۹۳۱ ). Pittman بیشتر توانست نشان بدهد که شش تیپ هموفیلوس آنفلوآنزا بوسیله سرولوژی اختصاصی کپسولشان از a-f قابل تیپ­بندی هستند. به طور عمده سویه تیپ (Hib) b باعث حملات اصلی بیماری از جمله: مننژیت و سپتی­سمیا و به دنبال آن اپی­گلوتیت، سلولیت، آرتریت­سپتیک، پنومونی می­شوند(آلکساندر، ^[۴]۱۹۶۵). سویه بدون کپسول (غیر قابل تیپ­بندی) منجر به: اوتیت مدیا، سینوسیت و عفونت حاد دستگاه تنفسی تحتانی می­ شود.بیشترین احتمال آلودگی به بیماری مرتبط با هموفیلوس آنفلوآنزا، کودکان بین سنین ۱۰ تا ۱۶ ماه هستند و اخیراً به عامل اصلی میلیونها مرگ در کشورهای در حال توسعه تبدیل شده­است. در طی این زمان، کودکان به طور کامل بوسیله سیستم محافظتی آنتی­بادی محافظت نمی­شوند و همچنین در سرمشان آنتی­بادی­های توسعه یافته وجود ندارد (فاترگیل و همکاران،^[۵]۱۹۳۳) جلب توجه بیماری­زایی عفونت هموفیلوس آنفلوآنزا با ورود شیمی درمانی توسط مواد آنتی­میکروبیال کاهش پیدا کرد. با این وجود مرگ و میر ناشی از مننژیت که بوسیله هموفیلوس آنفلوآنزا در آمریکای شمالی در سال ۱۹۳۰ ایجاد شد تقریباً در ۱۰۰% از موارد مبتلا بود(تیلر وهمکاران،۱۹۹۰^[۶]). با ظهور آنتی­بیوتیک­ها مرگ و میر در اواسط سال ۱۹۶۰ به ۱۰-۵% کاهش پیدا کرد(هاگرتی وهمکاران،۱۹۶۴^[۷]- ترک وهمکاران،۱۹۶۷^[۸]) به هر حال، در کمتر از ۳۰% از افراد زنده­مانده نقص جدی همانند: اختلال در بینایی، شنوایی، حمله ناگهانی بیماری و زوال عقل دیده­ می شد.(اسپرولس وهمکاران،۱۹۶۹^[۹] ،کروک و همکاران،۱۹۴۹^[۱۰])در طی سال ۱۹۷۰، مقاومت آنتی­بیوتیکی سویه­های Hib منجر به تکثیر و گسترش آن­ها شد. در سال ۱۹۹۱ تخمین زده شد که ۱۱% از سویه­های خالص شده هموفیلوس آنفلولآنزا تیپ b نسبت به آمپی سیلین و همچنین بیشتر آنتی بیوتیکهای معمول که برای درمان آلودگی به این ارگانیسم استفاده می­شد، مقاومت دارند.(بوی وهمکاران،۱۹۹۱^[۱۱]). Jenner و همگارانش مقاومت فوق­العاده و غیرمنتظره سویه­های هموفیلوس آنفلوآنزا را به کلرومنفنیکل در سال ۱۹۹۰ گزارش کردند. (جنر و همکاران،۱۹۹۰^[۱۲]) بیماری­زایی هموفیلوس آنفلوآنزا فقط تنها موضوع اصلی در مورد این باکتری نبود، بلکه موضوع ژنتیک بنیادی و تحقیقات مولکولی نیز مطرح بود. در اوایل ۱۹۵۰، هموفیلوس آنفلوآنزا به عنوان دومین نمونه بعد از پنوموکوکوس به عنوان یک ارگانیسم قابل ترنسفورم شدن شناسایی شد. سپس در اواخر ۱۹۶۰، Hamilton smith روی نوترکیبی همولوکوس در هموفیلوس آنفلوآنزا تحقیق کرد، که این تحقیقات به طور مستقیم منجر به کشف تیپ II آنزیم­ های اندونوکلئازی محدود کننده شد، که این آنزیم در تکنولوژی DNA نوترکیب بسیار مورد استفاده قرار گرفت. تحقیقات مولکولی و ایمونولوژیکی برروی کپسول پلی­ساکاریدی فوکوس پیدا کرد که بعدها منجر به توسعه و تجارت و انتشار اولین واکسنهای پلی­ساکاریدی- کونژوگه در سال ۱۹۸۹ شد. در سال ۱۹۹۵ هموفیلوس آنفلوآنزا اولین باکتری آزادزی بود که ژنومش به طور کامل سکانس­بندی شد(فلیچمن،۱۹۹۵^[۱۳]). این کار بزرگ بسیار قابل توجه بود و باعث شد که سکانس­بندی ژنوم بسیاری دیگر از باکتریها آغاز شود و استفاده از ژنوم و بیوانفوزماتیک در تحقیقات میکروبیولوژی شروع شود .
شکل ۱-۱
کلونی هموفیلوس آنفلوانزا در محیط شکلات آگار
۱-۱-۲ میکروبیولوژی