Nitrofurantoin
۵
۶۴≤
۳۲
۱۶≥
۳۰
K
Kanamycin
۶
۳۲≤
۱۶
۸≥
۳۰
CH
Chloramphenicol
۷
تصویر۳-۲ آنتی بیوگرام به روش دیسک گذاری
تصویر۳-۳ MIC به روش ADM
۳-۷-استخراج پلاسمید با بهره گرفتن از کیت :
برای استخراج پلاسمید از کیت یکتا تجهیز آزما ( Lot:BDC20114113 ,Cat:YT9001) بر اساس دستوالعمل شرکت سازنده کیت استخراج پلاسمید صورت گرفت.
۳-۸-نحوه استفاده ازکیت:
۱- میکروارگانیسم به مدت ۱دقیقه در g10000سانتریفیوژ شد.
۲- رسوب باکتری در μL 200ازبافرPD1 بااستفاده ازپیپتاژ بصورت سوسپانسیون درآمد.
۳-میزان μL200 ازبافرPD2 رابه لوله اضافه کرده وبه آرامی ۱۰ باربههم زده تاسلول ها لیزشده سپس بهمدت ۲دقیقه دردمای اتاق گرمخانه گذاری گردید.
۴-μL 300 ازبافرPD3 اضافه و۱۰ بار به آرامی مخلوط گردید.
۵-لوله ها بهمدت ۵ دقیقه درg 10000سانتریفیوژ شدند.
۶-بادقت مایع رویی به درون ستون PD انتقال داده شد و به مدت ۳۰ ثانیه با سرعتrpm 14000 سانتریفیوژشد.
۷-میزانμL400 بافرW1 را به درون ستون PD انتقال داده و آنرا به مدت ۳۰ ثانیه با سرعت rpm 14000 سانتریفیوژکرده و مایع زیرین بار دیگر به درون ستون انتقال داده شد.
۸-μL 600 بافر شستشو به درون ستون PD اضافه گردید و به مدت ۳۰ ثانیه با سرعت rpm 14000 سانتریفیوژ شد.
۹-ستون PD درون یک لوله جمع کننده جدید قرار داده شد و میزان μL 100تا ۵۰ از بافر شستشو به مرکز غشاء ستون اضافه گردید و بهمدت ۲دقیقه به همان حالت قرارداده شد.
۱۰- محلول زیرین بهمدت یک دقیقه سانتریفیوژ شد و در یخچال قرارداده شد و سپس μL 250بافر TE به آن اضافه گردید.
۳-۹-روش انجام الکتروفورز:
پس ازتهیه ژل آگارز۲/۱ درصد میزان lμ۵ از اتیدیوم بروماید به آن اضافه وآن را داخل کاست ریخته تاسفت شد، سپس در داخل تانک الکتروفورزحاوی بافرSB (به طوری که چاهک ها درقطب منفی قرارگیرند) قرارداده شد به طوری که ژل کاملا̋ درSB بافرغوطه ور و سطح بافر در تانک حدود ۱تا۲میلی لیتر بالاتر از سطح ژل بود. سپس lμ۵ از محصولات استخراج پلاسمید، با lμ۲ از محلول بارگذاری [۲۶]مخلوط و با دقت در داخل چاهک ها ریخته شدند. همچنین به همراه نمونه ها درداخل یکی از چاهک ها به میزان lμ۷ لدر[۲۷]۲ به منظور شناسایی طول باندها ریخته شد. سپس منبع تغذیه الکتریکی متصل به تانک راروشن کرده والکتروفورز با ولتاژ۱۵۰ به مدت ۴۵ دقیقه انجام گردید. بعدازاتمام الکتروفورز منبع تغذیه راخاموش و سپس به منظور بررسی وعکس برداری ژل دردستگاه Gel documentationقرار داده و از ژل عکس گرفته شد.
۳-۱۰-تهیه سلول های مستعد E. coli به روش کلرید کلسیم:
مواد مورد نیازبرای تهیه سلول های مستعد E. coli
برای تهیه سلول های مستعد به روش کلرید کلسیم، محلول CaCl₂-MgCl₂ موردنیاز است که این محلول به صورت mM CaCl₂ ۲۰وmM MgCl₂ ۸۰ تهیه و با فیلتر میلی پور(اندازه منافذ µ۲/۰) استریل شد. با اضافه کردن۲۰درصد گلیسرول به این محلول می توان ازآن برای نگهداری سلول های مستعد در درازمدت استفاده کرد.
روش تهیه سلول های مستعدE. c oli :
تهیه سلول های مستعد به روش کلرید کلسیم طبق مراحل زیرصورت گرفت : [۶۴].
۱) یک کلنی تازه ازباکتری E. coli در۵ میلی لیترمحیط LB کشت و در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد در انکباتورشیکردار در دور rpm250-200، به مدت ۵-۴ ساعت قرار داده شد.
۲) یک میلی لیتراز محلول فوق به ۱۰۰میلی لیترمحیطLB منتقل شد ومانند مرحله قبل گرمخانه گذاری گردید.
۳) درطول موج ۶۰۰ نانومتر،جذب نوری (OD) نمونه درزمان های مختلف کنترل شد تا به میزان ۶/۰- ۴/۰ برسد که دراین جذب نوری باکتری E. coli در فاز لگاریتمی رشد خود قرار می گیرد و بهترمستعد می گردد.
۴) ۳۰ میلی لیتراز نمونه به یک لوله سانتریفیوژ۵۰ میلی لیتر استریل انتقال داده شد وبرروی یخ به مدت ۱۰ دقیقه قرار داده شد.
