شکل۲-۱ ……………………………………………………………………………………………………………………۵۴
شکل ۳-۱٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫۵۹
شکل ۴-۱ …………………………………………………………………………………………………………………..۶۰
شکل ۴-۲٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫۶۰
شکل ۴-۳٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫۶۳
شکل ۴-۴٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫۶۴
شکل ۴-۵٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫۶۶
شکل ۴-۶٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫۶۶
شکل ۴-۷٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫۶۷
شکل ۴-۸٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫۶۸
شکل ۴-۹٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫۶۹
شکل ۴-۱۰٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫۷۰
شکل ۴-۱۱٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫۷۱
شکل ۴-۱۲ ………………………………………………………………………………………………………………..۷۲
شکل ۴-۱۳٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫۷۲
شکل ۴-۱۴٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫۷۳
فهرست جداول
جدول۲-۱٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫۴۶
جدول ۳-۱٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫۵۷
جدول ۳-۲٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫۵۷
جدول ۳-۳٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫۵۸
جدول ۳-۴٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫۵۹
جدول ۴-۱٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫۶۱
جدول ۴-۲ …………………………………………………………………………………………………………………۶۱
فصل اول
مقدمه
۱-۱ مقدمه
کنجد (Sesamum indicum L.) گیاه یک‌ساله، خودگشن با دیرینه زراعی طولانی که به علت دارا بودن درصد زیاد روغن و مقدار مناسب پروتئین به‌عنوان یک منبع تغذیه‌ای محسوب می‌شود (نصر، ۱۳۸۲). سطح زیر کشت جهانی کنجد در سال ۲۰۱۰ میلادی، در میان ۱۰ کشور عمده تولیدکننده کنجد در جهان، کشور میانمار با تولید ۰۰۰/۷۲۰ تن در رتبه اول تولید قرار دارد. کشور هند با تولید ۰۰۰/۶۲۰ تن در رتبه دوم و چین با تولید ۰۰۰/۵۹۰ تن در رده سوم قرار دارد که در این‌ بین ایران با تولید ۳۱۸۴۸ تن در رده دهم قرار دارد. متوسط عملکرد کنجد در جهان در این سال ۴۹۰ کیلوگرم در هکتار بوده است (فائو، ۲۰۱۰). مناطق اصلی کشت کنجد در کشور استان‌های فارس، خوزستان، جیرفت، بوشهر، اردبیل (مغان)، خراسان شمالی می‌باشد. پنج استان فارس، خوزستان، جیرفت، خراسان رضوی و اردبیل همه‌ساله ۸۰ درصد سطح زیر کشت کنجد کشور را به خود اختصاص داده‌اند. در سال ۱۳۹۱ سطح زیر کشت کنجد در کشور به ۴۳۴۷۵ هکتار با تولید ۳۹۶۱۴ تن و عملکرد ۹۱۲ کیلوگرم در هکتار بوده است.
کنجد به اسامی Till, Simsim, Gingelly, Benni,Seed معروف است. کنجد از دانه‌های روغنی مناطق گرم و نیمهگرم است، ولی کشت ارقام جدید آن به مناطق معتدله نیز گسترش‌یافته است. این گیاه دارای ارقام محلی زیادی است و در اغلب کشورها توسط کشاورزان خرده‌مالک و به‌صورت سنتی کشت و کار می‌شود (وایز، ۲۰۰۰). مقدار روغن در زمان رسیدگی فیزیولوژیکی به سطح ثابتی می‌رسد و تا زمان رسیدگی بذر نوسان اندکی دارد (فلوئر و داونی، ۱۹۷۰). آبیاری می‌تواند موجب افزایش مقدار روغن شود، درصورتی‌که تنش خشکی (میلر و رایتن، ۱۹۸۷) موجب کاهش آن می‌شود و به‌طورکلی عوامل محیطی اثرات معکوس بر مقدار روغن و پروتئین دارند. ازنظر درصد روغن و عملکرد روغن دانه ارقام مقاوم به تنش موفق‌تر عمل می‌نمایند (اسمیت، ۱۹۹۰). کشور ایران ازنظر اقلیمی در منطقه خشک نیمه‌ خشک دنیا قرار دارد، ازاین‌رو خشکی یکی از مشکلات پیش روی زراعت کشور ماست. خشکی سبب تغییرات مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی متعددی در گیاهان می‌شود ضمن اینکه تحمل به خشکی در گیاهان نیز خصوصیتی ثابت نبوده و ممکن است در مراحل مختلف رشد هرگونه، متفاوت باشد (سایرام،۲۰۰۱). به‌طورکلی گیاهان، طیف وسیعی از تنش‌های محیطی را که نهایت منجر به بروز تنش اکسیداتیو می‌شود، درک می‌کنند. مکانیسم مقاومت در برخی از تنش‌ها به‌صورت یک ارتباط درونی و نتیجه یک برنامه‌ریزی هماهنگ و پیچیده است. در شرایط تنش عدم توازن بین فرایند جذب انرژی و مصرف آن توسط اندام فتوسنتزی باعث تولید انواع اکسیژن فعال (ROS) و ناتوانی گیاه در مهار آن می‌گردد که درنهایت منجر به بروز تنش در غشای سلول و بروز علائم ناشی از صدمات اکسیداتیو شود (بلوخینا و همکاران، ۲۰۰۳). افزایش میزان رادیکال‌های فعال اکسیژن در گیاه باعث می‏شود که برای کاهش اثرات سمی تنش اکسیداتیو ناشی از تنش خشکی، مکانیسم‌های متنوعی در گیاه فعال شود. در این شرایط میزان آنتی‌اکسیدانت­ها افزایش‌یافته و آنزیم‌های مهارکننده ROSها در جهت کاهش اثرات سمی ناشی از تنش اکسیداتیو حاصل از تنش خشکی، افزایش پیدا می‌کنند (کافی و همکاران،۱۳۸۲). برای مقابله با تنش اکسیداتیو آنزیم‌های آنتی­‌اکسیدانت نظیر کاتالاز (CAT)، پراکسیداز (POD)، آسکوربات پراکسیداز (APX)، سوپر­اکسید ­دیسموتاز (SOD) و گلوتاتیون ردوکتاز (GR) باعث حذف و غیرفعال شدن گونه های فعال اکسیژن می‏شوند (دیرینک و مونتاگو،۲۰۰۲).

لذا بررسی اثرات تنش خشکی و الگوی رفتاری آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانت، می‌تواند به درک مکانیسم‌های دخیل در القاء مقاومت یا تحمل به گیاه کمک نماید، چراکه همبستگی بالایی در تحمل به تنش‌های محیطی و تغییرات غلظت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانت در گیاهان فتوسنتز کننده وجود دارد. از سوی دیگر با عنایت به اینکه سنتز هر ماده‌ای در سلول تحت کنترل ژن‌های مسئول سنتز آن است انتقال این ژن­ها به گیاهان دیگر و تولید ارقام محتمل به خشکی دور از ذهن نخواهد بود.
اهداف تحقیق حاضر عبارت‌اند از:
۱- مقایسه الگوی بیان برخی ژن‌های دخیل در تنش خشکی در سطح آنزیم شامل کاتالاز، سوپراکسید دیسموتاز و آسکوربات پراکسیداز و پراکسیداز در بافت برگ و ریشه
بررسی الگوی بیان برخی ژن‌های دخیل در تنش خشکی در سطح ترانسکریپتوم
۱-۲ کلیات
۱-۲-۱ گیاهان و تنشهای محیطی
گیاهان در دوره حیاتشان با انواع تنشهای محیطی مواجه می‌شوند، این تنش‌ها شانس نمو و بقای گیاهان را محدود می‌کنند. در بسیاری از نقاط کره خاکی شرایط مناسب رشد فقط برای مدت کوتاهی دوام دارد و گیاهان مجبورند که در همین زمان کم، مراحل اساسی رشد خود را انجام دهند در برخی نقاط هم که شرایط برای رشد مناسب است، افزایش تراکم و تعداد گیاهان عامل ایجاد رقابت برای گیاهان در به دست آوردن مواد غذایی، آب و نور است (لارچر و همکاران، ۲۰۰۱).
درمجموع تنش یعنی شرایط نامناسبی که حتماً مرگ آنی در پی نداشته و به‌طور دائم یا موقت در یک محل اتفاق می‌افتد ولی بر عملکردهای حیاتی موجودات تاثیرداشته باشد (والتر و همکاران، ۱۹۸۵). از قوانین حرکت نیوتن چنین استنباط شده است که اگر هر موجودی تحت تاثیرعملی (تنش) قرارگیری عکس‌العملی (واکنش) از خود نشان می‌دهد. واکنش می‌تواند برگشت‌پذیر یا برگشت‌ناپذیر باشد. اگر واکنش از شدت کافی برخوردار باشد موجود زنده دچار یک تغییر پایدار یعنی صدمه یا مرگ می‌شود.
به‌هرحال دانشمندان علوم گیاهی تنش را با دو تعریف بوم‌شناختی و بیوشیمیایی موردتوجه قرار می‌دهند. تنش در مفهوم بوم‌شناختی: فشارهای زیست‌محیطی است که نسبت تولید ماده خشک را در قسمتی از گیاه یا تمامی آن محدود می‌کند اما تنش ازنظر بیوشیمیایی به معنی اختلال در تولید طبیعی ترکیبات مختلف گیاهی است. امروزه تنش را به دو گروه طبقه‌بندی می‌کنند اول تنش‌های زیستی^[۱]: تنش‌هایی که حاصل حمله یک موجود زنده به موجود زنده دیگر است مانند آفت‌ها، پاتوژنها و آللوپاتی؛ دوم تنش‌های غیر زیستی^[۲] شامل:
۱- باد، فشار، صدا، نیروهای مغناطیسی و الکتریکی
۲- شیمیایی، مثل شوری، یونی، علف‌کش‌ها و…
۳- تشعشع، مثل پرتوهای A-B, UV- UV
۴-آب، مثل غرقابی و خشکی
۵- دما، مثل گرماو سرما
هر نوع از تنش‌ها در وهله اول تنش اولیه محسوب شده و منجر به تغییراتی در سیستم زیستی می‌شود.
اگر مدت‌زمان تنش اولیه کوتاه باشد اثرات آن در حد چند ثانیه یا دقیقه مشاهده می‌شوند؛ اما اگر مدت‌زمان بروز تنش طولانی باشد تنش ثانویه پدید آمده و آسیب حاصل از آن غیرمستقیم خواهد بود. گیاهان نیزمانندجانوران برای مقابله با این شرایط ناسازگارو سخت با بهره گرفتن از مکانیسم‌های متفاوت با تنش مقابله می‌نمایند که این مکانیزم‌ها شامل سازش و مقاومت بوده که مقاومت خود شامل تحمل کردن، اجتناب و فرار می­باشد (پارساد، ۱۹۹۶).
همه این تنش‌ها، پاسخ‌های مشترکی را در گیاهان القا می‌کنند ولی در شروع سیگنال باهم تفاوت داشته و همچنین گیرنده‌های آن‌ها متفاوت می‌باشند. این تنش‌ها با بیان یک سری از ژن‌ها گیاه را قادر به ترمیم آسیب ناشی از تنش کرده یا گیاه را در برابر تنشهای محیطی که آینده پیش خواهد آمد حمایت می‌کنند (باجوز و همکاران، ۲۰۰۸)؛ یعنی درواقع گیاه را با محیط سازگار کرده و بقای آن را بیشتر تأمین و تضمین می‌کنند و از این طریق به‌نوعی با محیط خود سازش یافته یا تطابق می‌یابند. سازش‌ها اعم از مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی به نحوی انجام می‌گیرد که گیاه بتواند بهتر با محیط تطابق پیدا کند و از امکانات مادی محیط خود به گونه شایسته‌ای استفاده کند. به‌طور مثال سازش بیوشیمیایی در گیاهان شامل انواع تغییرات بیوشیمیایی در سلول است. این تغییرات شامل تکامل راه های متابولیکی جدید، تجمع متابولیک‌های با وزن مولکول کم، سنتز پروتئین‌های خاص، مکانیسم‌های سم‌زدایی و تغییر در میزان فیتوهورمونها می‌باشند (باجوز و همکاران، ۲۰۰۸). در اغلب تنشهای محیطی، تغییرات ایجادشده گیاهان را در مواجهه با تنش کمک می‌کنند. یکی از عمده‌ترین تنشهای محیطی که اغلب گیاهان با آن مواجهند تنش خشکی می­باشد.
۱-۲-۲ تنش خشکی