Primer reverse

۱۰mM

./۱mM

./۵

Primer forward

۱۰mM

./۱mM

./۵

Taq enzyme

۵U/µ

۱/۵U

./۱۲۵

DNA

۱µg/µL

۱

H2O

۱۹/۳۷۵

جدول ۲-۳ : مقدار مواد مورد استفاده در مخلوط PCRدر حجم µl25
۲-۴-۱ : شرایط تکثیرقطعه مورد نظر عبارت است از:
۳۵ سیکل را شامل می شود دناتوراسیون اولیه در دمای ْC 94 به مدت ۵ دقیقه ، دمای ذوبCْ ۶۰ به مدت ۶۰ ثانیه و دمای گسترش C^ْ ۷۲ به مدت ۵۰ثانیه است.
۲-۴-۲ : مراحل PCR:
دناتوراسیون اولیه در دمای ˚C94 به مدت ۵ دقیقه
دناتوراسیون در دمای ˚C94 به مدت ۴۰ ثانیه
اتصال پرایمرها در دمای ˚C60 به مدت ۵۰ ثانیه
گسترش در دمای ˚C72 به مدت ۵۰ ثانیه
گسترش نهایی به مدت ۵ دقیقه
۲-۵ : الکتروفورز ژل آگاروز:
۲/۰ گرم پودر آگاروز را با ۲۰ میلی لیتر بافرTBE o.5x مخلوط کرده به مدت ۴۰ ثانیه درون ماکروویو قرار می دهیم. بعد از سرد شدن ۳ میکرولیتر اتیدیوم بروماید به آن اضافه می کنیم سپس آن ها را درون تانک ژل ریخته وشانه مخصوص را جهت ایجاد چاهک درون آن قرار می دهیم، و به مدت ۳۰ دقیقه می گذاریم تا ببندد. ژل را درون تانک الکتروفورز گذاشته و مخلوط محصول PCR و بافر الکتروفورز (۵ میکرولیتر محصولPCR به همراه ۲ میکرولیتر بافر PCR) را درون چاهک ها ریخته، تانک را به ولتاژ ۱۰۰ وصل کرده و ۳۰ دقیقه صبر می کنیم، به جهت تشخیص صحیح قطعه مورد نظر در چاهک اول Ladder می ریزیم برای مشاهده قطعات روی ژل از دستگاه U.V استفاده می کنیم پس از انجام PCR جهت بررسی جهش از تکنیک SSCP برای آنالیز نمونه ها استفاده شد.

۲-۶ : آنالیز ژل SSCP:
برای انجام SSCP از ژل پلی آکریل آمید استفاده می شود این ژل منافذ ریزتری دارد، و با بهره گرفتن از این تکنیک تغییرات ژنی حتی در حد یک نوکلئوتید قابل تشخیص است. با بهره گرفتن از این روش می توان به جهش های نقطه ای پی برد و یا مثلا آلل های مختلف یک ژن را که طول مساوی دارند که فقط در یک یا چند نوکلئوتید با هم فرق دارند از هم تشخیص داد.
. ۲-۷ : آماده سازی ژل پلی آکریل آمید:
طی مراحل زیر ژل آکریل آمید را آماده کرده و درون تانک قرار می دهیم:
برای ساختن ژل ۸ درصد پلی آکریل آمید، از محلول بیس آکریل آمید (۸/۴ میکرولیتر)، TBE 10x (4/2 میکرولیتر )، گلیسرول ( ۴/۲ میکرولیتر )، به حجم ۲۴ میکرولیتر می رسانیم وAPS وTEMED استفاده شد.
برای مرحلۀ پیش ران، تانک را به ولتاژ ۱۰۰ به مدت ۳۰ دقیقه وصل می کنیم. بعد با قطع جریان ۶ میکرولیتر از محصول PCR با ۱۰ میکرولیتر بافر SSCP مخلوط کرده و به مدت ۳ دقیقه در حرارت ۹۴ درجه قرار می دهیم. بلافاصله میکروتیوپ ها را داخل یخ به مدت ۵ دقیقه قرار می دهیم سپس نمونه ها را به درون چاهک های ژل می ریزیم و تانک را به مدت ۲۰ ساعت به ولتاژ ۱۱۰ وصل می کنیم و سپس رنگ آمیزی ژل پلی آکریل آمید توسط نیترات نقره صورت می گیرد.
۲-۸ : مراحل رنگ آمیزی ژل پلی آکریل آمید:
ژل را درون ظرف رنگ آمیزی قرار داده و ۵۰ میلی لیتر از بافر A (4/10 میلی لیتر اتانول ۹۶ درصد به همراه ۵۰۰ میکرولیتر اسیداستیک ، به حجم نهایی ۱۰۰ میلی لیتر می رسانیم) را به روی ژل می ریزیم و به مدت ۵ دقیقه با سرعت ۱ روی شیکر قرار می دهیم.
محلول A را خالی کرده و ژل را با آب مقطر شست و شو می دهیم و بقیه محلول را به درون ظرف اضافه کرده و دوباره به مدت ۵ دقیقه با سرعت ۱ به روی شیکر قرار می دهیم.
محلول A را خالی کرده و ژل را با آب مقطر شتشو می دهیم و سپس محلول B (4/10 میلی لیتر اتانول ۹۶ درصد ، ۵۰۰ میکرولیتر اسیداستیک به همراه ۲/۰ گرم نیترات نقره را با آب اتوکلاوه به حجم ۱۰۰ میلی لیتر می رسانیم) را به روی ژل ریخته و به مدت ۱۵ دقیقه با سرعت ۱ به روی شیکر قرار می دهیم.