پژوهش های کارشناسی ارشد درباره بررسی تنوع آللی ژن های کاندیدای تحمل به تنش ...

ارسال شده در 16 آبان 1400 توسط نجفی زهرا در بدون موضوع

F: AAGCCAAGAGAGGGTCGTTG
R: AGCGCAACATCCACAAACTATAAC

۲-۶ تهیه نمونه DNAی ژنومی
برای تهیه نمونه DNAی ژنومی، برگهای تازه گیاه از گیاهچههای ۱۴ روزه گیاه جو جدا شده و به مدت ۳ روز در دستگاه Dryfreez قرار داده شدند تا آب میان بافتی آنها کاملاً خشک شود. سپس نمونههای برگی با دستگاه گریندر کاملاً پودر شده و برای استخراج DNA آماده شدند. DNAی ژنومی از نمونه گیاهی هر ژنوتیپ طبق روش سقائی و همکاران (۱۹۸۴) با اندکی تغییرات استخراج گردید.

شکل ۲- ۵ گیاهچههای ۱۴ روزه که برای تهیه نمونه برگی استفاده شدند.

شکل ۲-۷ دستگاه گریندر برای پودر کردن نمونههای برگی
شکل ۲-۶ دستگاه Freezdryer برای خشک کردن
نمونههای برگی
۲-۷ تعیین کیفیت و کمَیَت نمونه های DNA
کیفیت و کمَیَت نمونه DNA های استخراج شده روی ژل آگارز ۱% تعیین گردید. برای تعیین کیفیت DNA، یک میکرولیتر از DNAی ژنومی هر نمونه گیاهی همراه با ۲ میکرولیتر بافر لود کننده روی ژل آگارز لود شد. برای تعیین کمَیَت DNA از DNAی لامبدا استفاده گردید. صد نانوگرم از آن در یک سمت ژل و ۲۰۰ نانوگرم در سمت دیگر ژل همراه با نمونههای DNA استفاده گردید. سپس از روی تصاویر ژل و با توجه به وضعیت DNAی لامبدا روی آن، غلظت نمونههای DNA تخمین زده شد. شکل ۲-۸ تصویر ژل نمونههای DNAی استخراج شده را نشان میدهد. پس از تعیین غلظت استوکهای DNA، نمونههای رقیق شده DNA با غلظت ۱۵ نانوگرم در میکرولیتر تهیه شد. برای رقیق کردن استوک DNA میتوان از آب استریل دوبار تقطیر و یا بافر ۱/۰ TE استفاده کرد اما برای توالییابی بهتر است از نمونه DNAهایی که با آب مقطر رقیق شده اند استفاده نمود (زیرا بافر TE موجب ایجاد برخی اختلالات در دنیچره شدن دو رشته DNA در محصول PCR میگردد).
لامبدای ۲۰۰ نانوگرم لامبدای ۱۰۰ نانوگرم
شکل ۲-۸ تصویرژل نمونههای DNA
-۸
۲-۸ واکنش زنجیرهای پلیمراز برای تست پرایمرها
مناطق ژنومی محدود به توالی فوروارد و ریورس هر جفت پرایمر از طریق واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) تکثیر شده و محصولات PCR روی ژل آگارز مورد ارزیابی قرار گرفتند. مقادیر مواد مورد نیاز برای انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز در جدول ۲-۲ آورده شده است. این مواد از جمله بافر PCR، dNTP، MgCl2 و آنزیم DNA تک پلیمراز از شرکت فرمنتاز تهیه شده اند. پرایمرهای مورد استفاده در این آزمایش از شرکت WMG تهیه گردیدند. برای تکثیر قطعات ژنومی مورد نظر ابتدا یک چرخه دمایی ۹۴ درجه سانتی گراد به مدت ۵ دقیقه، سپس ۱۰ چرخه دمایی شامل، دمای ۹۴ درجه سانتی گراد به مدت ۳۰ ثانیه، ۶۸ درجه سانتی گراد به مدت ۳۰ ثانیه و ۷۲ درجه سانتی گراد برای یک دقیقه اعمال گردید که در هر چرخه یک درجه دمای انلینگ (۶۸ درجه) کاهش یافته و پس از چرخه دهم این دما به ۵۸ درجه سانتی گراد تقلیل یافت. سپس ۳۵ چرخه شامل دمای ۹۴ درجه سانتی گراد به مدت ۳۰ ثانیه، ۵۸ درجه سانتی گراد ۳۰ ثانیه و ۷۲ درجه سانتی گراد به مدت ۲ دقیقه اعمال گردید. در انتها ۵ دقیقه در دمای ۷۲ درجه سانتی گراد قرار داده شد تا تکثیر قطعات تکمیل گردد. دستگاه PCR مورد استفاده در این آزمایش مدل ABI Vertri 96 بوده است. ABI Vertri 96 Thermal CyclerABI Vertri 96 Thermal Cycler ABI Vertri 96 Therm
شکل ۲-۹ دستگاه ترموسایکلر مدل
ABI Vertri 96
جدول ۲-۲ مواد مورد نیاز برای واکنش PCR